定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)に基づく ヘリコバクターピロリ 感染と抗生物質耐性の迅速診断
Summary
このプロトコルは、ストリングテストを通じて ヘリコバクターピロリ 胃感染症を迅速に診断するための非侵襲的な方法を提示し、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を使用してクラリスロマイシンとレボフロキサシンに対する抗生物質耐性を決定します。
Abstract
ヘリコバクターピロリは、世界人口の約半分に感染する主要なヒト病原体であり、抗生物質耐性の増加により深刻な健康上の脅威になりつつあります。慢性活動性胃炎、消化性潰瘍疾患、胃がんの原因物質であり、国際がん研究機関によってグループIの発がん性物質に分類されています。したがって、ピロリ菌の迅速かつ正確な診断とその抗生物質耐性の決定は、この細菌性病原体の効率的な根絶にとって重要です。現在、ピロリ菌の診断方法には、主に尿素呼気検査(UBT)、抗原検査、血清抗体検査、胃鏡検査、迅速ウレアーゼ検査(RUT)、および細菌培養が含まれます。その中で、最初の3つの検出方法は非侵襲的であり、実施しやすい検査です。ただし、これらの手法では細菌を回収することはできません。したがって、薬剤耐性試験は実施できない。最後の3つは侵襲的な検査ですが、費用がかかり、高度なスキルが必要であり、患者に損害を与える可能性があります。したがって、ピロリ菌の検出と薬剤耐性試験のための非侵襲的、迅速、同時の方法は、臨床現場で効率的にピロリ菌を根絶するために非常に重要です。このプロトコルは、ピロリ菌感染と抗生物質耐性を迅速に検出するための定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)と組み合わせたストリングテストを含む特定の手順を提示することを目的としています。細菌培養とは異なり、この方法は、ピロリ菌の感染状態と薬剤耐性の容易、迅速、非侵襲的な診断を可能にします。具体的には、qPCRを用いて、ピロリ菌感染のレアと、クラリスロマイシンとレボフロキサシンに対する耐性をそれぞれコードする23S rRNAおよびgyrA遺伝子の変異を検出しました。日常的に使用されている培養技術と比較して、このプロトコルは、ピロリ菌感染を検出し、qPCRを使用して抗生物質耐性を決定するための非侵襲的、低コスト、および時間を節約する技術を提供します。
Introduction
ピロリ菌は、主に胃の幽門領域に生息するらせん状の運動性の高いグラム陰性菌です1。これは、世界人口の50%近くが感染する一般的な病原体です2。ピロリ菌感染症のほとんどの人は臨床症状がなく、慢性胃炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、胃がんなど、感染から数年後にさまざまな病気を発症します3。異なる集団に基づくいくつかの研究では、胃がんや前がん病変を予防するためのピロリ菌を排除することの有効性が実証されています4,5。そのため、世界保健機関(WHO)の国際がん研究機関は、予防措置としてピロリ菌の撲滅を勧告しています6。
ピロリ菌感染を特定するための非侵襲的方法の使用は、無症候性消化不良のほとんどの個人にとって治療の重要な要素です。尿素呼気検査(UBT)、ピロリ菌糞便抗原検査(SAT)、および血清学的検査は、一般的な非侵襲的技術です。これらの中で、UBTは利用可能な最も侵入が少なく、最も正確な手順です。UBTは、ピロリ菌に豊富に存在するウレアーゼを使用して、同位体標識された尿素をアンモニアと二酸化炭素(13Cまたは14C)に加水分解します。対照的に、イムノクロマトグラフィーアッセイ(ICA)7は、サンプリングに便利でシンプルで非侵襲的です。ただし、テストの精度は、便サンプルの品質、温度、サンプル収集とテストの間隔など、いくつかの要因の影響を受けます。免疫応答に基づく別の検査は、患者の血清中の抗体を検出する血清H.ピロリ抗体検査です。ただし、この検査は、細菌が除去された後も抗体が長く残るため、処理後の分析には適していません8。もう一つの大きな欠点は、これらの方法はピロリ菌感染を診断するだけであり、感受性に基づく治療を導く薬剤耐性試験ができないことです。
侵襲的な検査法では、胃生検組織を内視鏡検査で採取し、組織学、ウレアーゼ迅速検査、細菌培養を行う必要があります。これらのテスト方法も、いくつかの要因により非常に制限されています。現在、これらの技術は、高齢患者、前癌性疾患または悪性疾患のリスクが高い患者、および胃食道逆流症または ピロリ菌 感染の一次治療に失敗した患者に限定されています9。第二に、 ピロリ菌の独特の増殖特性により、細菌培養の成功率は50%にしか達しません10。したがって、分子検出法は、侵襲的検出法の高い要求を克服し、感度ベースの治療を導くための新しい希望を提供します。分子検出法の中でも、定量PCRは近年大きく進化しています。qPCRは、従来のPCRとは異なり、ゲル電気泳動を必要とせず、アニーリング段階でプライマーとプローブを添加することにより、サンプル中のDNA/RNAを正確に定量します。 ピロリ菌 感染および薬剤耐性を検出するためのqPCRキットが市販されている。それにもかかわらず、各方法には制限があります。したがって、患者の臨床診断と治療は、症状、徴候、病歴、他の臨床検査、および治療への反応と組み合わせて考慮する必要があります。
現在、 ピロリ菌 感染症の治療方法は抗生物質の服用が主流ですが、最近では抗生物質耐性の上昇により治療が難しくなってきています。その後、ピロリ 菌 の治療効果の大幅な低下が世界的に観察され、 ピロリ菌 の根絶が主要な公衆衛生上の問題となっています11。
クラリスロマイシンとレボフロキサシンは、ピロリ菌によって引き起こされる感染症の治療に使用される2つの広域抗生物質ですが、いくつかの研究では、ピロリ菌分離株におけるこれら2つの薬剤に対する広範な耐性が報告されています。A2143G、A2142G、およびA2142Cは、2.9 kb 23S rRNA遺伝子に見られる多数の点突然変異のうちの3つであり、マクロライドの結合を妨げることによってクラリスロマイシン耐性をもたらします。同時に、レボフロキサシン耐性遺伝子の突然変異遺伝子座は、主にgyrA遺伝子12の6つの突然変異部位(A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G)に位置する。遺伝子変異に基づくこれらの耐性メカニズムの発見は、文化ベースの研究を通じて、ピロリ菌の検出が分子検査に徐々に移行することにつながりました。
全体として、 ピロリ菌 感染および薬剤耐性を検出するための非侵襲的、効果的、かつ同時診断法の緊急の臨床的必要性がある。ストリングテストとqPCRを組み合わせた方法を採用して、サンプリングの難しさを克服し、異なるプライマープローブを使用して ピロリ菌 感染と薬剤耐性を同時に検出するという目標を達成しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ピロリ菌 の検出は、侵襲的および非侵襲的方法の両方を用いて行うことができる13。組織病理学、迅速ウレアーゼ検査、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、細菌培養などの一般的に使用される侵襲的技術には、内視鏡検査と生検が必要です。血清学的検査、尿素呼気検査、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、非侵襲的手順の中で推奨されます14。非?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、深センの三明医学プロジェクト(助成金番号。SZSM201510050)および広東基礎応用基礎研究財団(助成金番号2022A1515220023)。広東省人民病院高度人材研究財団(No.KJ012021097)、および中国国家自然科学財団(81871734、82072380、82272423)。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も果たしていませんでした。
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
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