אבחון מהיר מבוסס תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR) של זיהום הליקובקטר פילורי ועמידות לאנטיביוטיקה
Summary
הפרוטוקול מציג שיטה לא פולשנית לאבחון מהיר של זיהומי קיבה של הליקובקטר פילורי באמצעות בדיקת מיתרים וקובע את עמידותו האנטיביוטית לקלריתרומיצין ולבופלוקסצין באמצעות תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR).
Abstract
הליקובקטר פילורי הוא פתוגן אנושי עיקרי המדביק כמחצית מאוכלוסיית העולם והופך לאיום בריאותי חמור בשל עמידותו הגוברת לאנטיביוטיקה. זהו הגורם הסיבתי של דלקת גסטריטיס פעילה כרונית, מחלת כיב פפטי וסרטן קיבה והוא סווג כמסרטן מקבוצה I על ידי הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן. לכן, האבחון המהיר והמדויק של H. pylori וקביעת עמידותו לאנטיביוטיקה חשובים למיגור יעיל של פתוגן חיידקי זה. כיום, שיטות האבחון של H. pylori כוללות בעיקר את בדיקת הנשימה אוריאה (UBT), בדיקת האנטיגן, בדיקת נוגדנים בסרום, גסטרוסקופיה, בדיקת אוראז מהיר (RUT) ותרבית חיידקים. ביניהן, שלוש שיטות הגילוי הראשונות אינן פולשניות, כלומר הן בדיקות קלות לביצוע. עם זאת, לא ניתן לאחזר חיידקים באמצעות טכניקות אלה; לפיכך, לא ניתן לבצע בדיקות עמידות לתרופות. שלוש האחרונות הן בדיקות פולשניות, אך הן יקרות, דורשות מיומנויות גבוהות ויש להן פוטנציאל לגרום נזק לחולים. לכן, שיטה לא פולשנית, מהירה וסימולטנית לזיהוי H . pylori ובדיקת עמידות לתרופות חשובה מאוד למיגור יעיל של H. pylori בפרקטיקה הקלינית. פרוטוקול זה נועד להציג הליך ספציפי הכולל את בדיקת המיתרים בשילוב עם תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR) לזיהוי מהיר של זיהום H. pylori ועמידות לאנטיביוטיקה. בניגוד לתרביות חיידקים, שיטה זו מאפשרת אבחון קל, מהיר ולא פולשני של מצב זיהום הליקובקטר פילורי ועמידות לתרופות. באופן ספציפי, השתמשנו ב-qPCR כדי לזהות rea עבור זיהום H. pylori ומוטציות בגנים 23S rRNA ו-gyrA , אשר מקודדים עמידות נגד clarithromycin ו-levofloxacin, בהתאמה. בהשוואה לטכניקות גידול שגרתיות, פרוטוקול זה מספק טכניקה לא פולשנית, בעלות נמוכה וחוסכת זמן כדי לזהות זיהום H. pylori ולקבוע את עמידותו לאנטיביוטיקה באמצעות qPCR.
Introduction
H. pylori הוא חיידק בצורת ספירלה, תנועתי מאוד, גראם-שלילי שחי בעיקר באזור הפילורוס של הקיבה1. זהו פתוגן נפוץ שמדביק כמעט 50% מאוכלוסיית העולם2. לרוב האנשים עם זיהום H. pylori אין ביטויים קליניים, ורובם מפתחים מחלות שונות לאחר מספר שנים של זיהום, כולל דלקת קיבה כרונית, כיבים פפטיים, כיבי קיבה וסרטן קיבה3. במספר מחקרים המבוססים על אוכלוסיות שונות,הודגמה יעילות סילוק H. pylori למניעת סרטן הקיבה ונגעים טרום סרטניים 4,5. לכן, ארגון הבריאות העולמי (WHO) הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן המליצה על מיגור H. pylori כאמצעי מניעה6.
השימוש בשיטות לא פולשניות לזיהוי זיהום H. pylori הוא מרכיב מרכזי בטיפול עבור רוב האנשים עם דיספפסיה אסימפטומטית. בדיקת נשימה אוריאה (UBT), בדיקת אנטיגן צואה H. pylori (SAT) ובדיקות סרולוגיות הן טכניקות לא פולשניות פופולריות. מבין אלה, UBT הוא ההליך הכי פחות פולשני ומדויק ביותר שיש. UBT משתמש באוראז, המצוי בשפע בהליקובקטר פילורי, כדי לבצע הידרוליזה של אוריאה עם תווית איזוטופית לאמוניה ופחמן דו חמצני (13C או 14C). לעומת זאת, הבדיקה האימונוכרומטוגרפית (ICA)7 נוחה, פשוטה ולא פולשנית לדגימה. עם זאת, דיוק הבדיקה מושפע ממספר גורמים, כגון איכות דגימת הצואה, הטמפרטורה והמרווח בין איסוף הדגימה לבדיקה. בדיקה נוספת המבוססת על התגובה החיסונית היא בדיקת נוגדנים בסרום H. pylori , המזהה נוגדנים בסרום של המטופל. עם זאת, בדיקה זו אינה מתאימה לניתוח לאחר הטיפול שכן הנוגדנים נשארים זמן רב לאחר ניקוי החיידק8. חסרון משמעותי נוסף הוא ששיטות אלה מאבחנות רק זיהום בהליקובקטר פילורי ואינן מאפשרות בדיקות עמידות לתרופות כדי להנחות טיפול מבוסס רגישות.
עבור שיטות בדיקה פולשניות, רקמת ביופסיית קיבה צריכה להילקח על ידי אנדוסקופיה ולאחר מכן נתון להיסטולוגיה, הבדיקה המהירה urase, ואת התרבות חיידקית. שיטות בדיקה אלה גם מוגבלות מאוד בשל מספר גורמים. כיום, טכניקות אלה מוגבלות לחולים קשישים, חולים בסיכון גבוה למחלה טרום סרטנית או ממאירה, וחולים שנכשלו בטיפול קו ראשון למחלת ריפלוקס קיבתי-ושטי או זיהום H. pylori 9. שנית, בשל מאפייני הגידול הייחודיים של H. pylori, שיעור ההצלחה של תרבית חיידקים מגיע רק 50%10. לפיכך, שיטות זיהוי מולקולרי מציעות תקווה חדשה להתגבר על הדרישות הגבוהות של שיטות גילוי פולשניות ולהנחות טיפול מבוסס רגישות. בין שיטות הזיהוי המולקולרי, PCR כמותי התפתח מאוד בשנים האחרונות. qPCR, בניגוד ל-PCR מסורתי, אינו דורש אלקטרופורזה בג’ל ומכמת במדויק DNA/RNA בדגימות על ידי הוספת פריימרים ובדיקות בשלב החישול. ערכות qPCR לזיהוי זיהום H. pylori ועמידות לתרופות זמינות כעת באופן מסחרי. עם זאת, לכל שיטה יש מגבלות; לכן, יש לשקול את האבחנה הקלינית והטיפול של המטופל בשילוב עם הסימפטומים שלו, הסימנים, ההיסטוריה, בדיקות מעבדה אחרות והתגובה לטיפול.
כיום, השיטה העיקרית לטיפול בזיהומים מסוג H.pylori היא נטילת אנטיביוטיקה, אך לאחרונה נעשה קשה יותר ויותר לטפל בזיהומים אלה בשל העלייה בעמידות לאנטיביוטיקה. לאחר מכן, נצפתה ירידה משמעותית ביעילות הטיפול בהליקובקטר פילורי ברחבי העולם, מה שהופך את מיגור ההליקובקטר פילורי לבעיה מרכזית בבריאות הציבור11.
Clarithromycin ו- levofloxacin הן שתי האנטיביוטיקות רחבות הטווח המשמשות לטיפול בזיהומים הנגרמים על ידי H.pylori, אך מספר מחקרים דיווחו על עמידות נרחבת נגד שתי תרופות אלה במבודדי H.pylori. A2143G, A2142G ו-A2142C הן שלוש מתוך מוטציות נקודתיות רבות שנמצאו בגן rRNA 23S 2.9 kb שגורמות לעמידות לקלריתרומיצין על ידי מניעת קישור המקרוליד. יחד עם זאת, מוקדי המוטציה של הגן לעמידות ללבופלוקסצין ממוקמים בעיקר בששת אתרי המוטציות (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) של הגן gyrA 12. גילוי מנגנוני עמידות אלה המבוססים על מוטציות גנטיות הוביל למעבר הדרגתי בזיהוי H. pylori דרך מחקרים מבוססי תרבות לבדיקות מולקולריות.
באופן כללי, קיים צורך קליני דחוף בשיטת אבחון לא פולשנית, יעילה וסימולטנית לאיתור זיהומים בהליקובקטר פילורי ועמידות לתרופות. אימצנו בדיקת מחרוזת משולבת ושיטת qPCR כדי להתגבר על קשיי הדגימה ולהשיג את המטרה של זיהוי סימולטני של זיהום H. pylori ועמידות לתרופות באמצעות בדיקות פריימר שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהוי H. pylori יכול להתבצע בשיטות פולשניות ולא פולשניות13. טכניקות פולשניות נפוצות כגון היסטופתולוגיה, בדיקת אוראז מהירה, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ותרבית חיידקים דורשות אנדוסקופיה וביופסיה. בדיקות סרולוגיות, בדיקות נשימה של אוריאה ובדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט Sanming של רפואה בשנג’ן (מענק מס ‘. SZSM201510050) וקרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (מענק מס’ 2022A1515220023). קרן המחקר לכישרונות מתקדמים של בית החולים העממי המחוזי גואנדונג (לא. KJ012021097), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81871734, 82072380, 82272423). למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה לפרסם או בהכנת כתב היד.
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
- Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12 (2022).
- Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
- Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
- Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
- IARC Helicobacter pylori Working Group. . Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , (2014).
- Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
- Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection – The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
- Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
- Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393 (2021).
- Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
- Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
- Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
- DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
- Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
- Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).
