Summary
प्रोटोकॉल स्ट्रिंग परीक्षण के माध्यम से हेलिकोबैक्टर पाइलोरी पेट के संक्रमण के तेजी से निदान के लिए एक गैर-आक्रामक विधि प्रस्तुत करता है और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) का उपयोग करके क्लैरिथ्रोमाइसिन और लेवोफ़्लॉक्सासिन के लिए इसके एंटीबायोटिक प्रतिरोध को निर्धारित करता है।
Abstract
हेलिकोबैक्टर पाइलोरी एक प्रमुख मानव रोगज़नक़ है जो वैश्विक आबादी के लगभग आधे हिस्से को संक्रमित करता है और इसके बढ़ते एंटीबायोटिक प्रतिरोध के कारण एक गंभीर स्वास्थ्य खतरा बनता जा रहा है। यह क्रोनिक सक्रिय गैस्ट्र्रिटिस, पेप्टिक अल्सर रोग और गैस्ट्रिक कैंसर का प्रेरक एजेंट है और इसे इंटरनेशनल एजेंसी फॉर रिसर्च ऑन कैंसर द्वारा ग्रुप 1 कार्सिनोजेन के रूप में वर्गीकृत किया गया है। इसलिए, एच पाइलोरी का तेजी से और सटीक निदान और इसके एंटीबायोटिक प्रतिरोध का निर्धारण इस जीवाणु रोगज़नक़ के कुशल उन्मूलन के लिए महत्वपूर्ण है। पाइलोरी निदान विधियों में मुख्य रूप से यूरिया सांस परीक्षण (यूबीटी), एंटीजन परीक्षण, सीरम एंटीबॉडी परीक्षण, गैस्ट्रोस्कोपी, रैपिड यूरिया टेस्ट (आरयूटी), और बैक्टीरियल कल्चर शामिल हैं। उनमें से, पहले तीन पहचान विधियां गैर-आक्रामक हैं, जिसका अर्थ है कि वे संचालन करने के लिए आसान परीक्षण हैं। हालांकि, इन तकनीकों के माध्यम से बैक्टीरिया को पुनः प्राप्त नहीं किया जा सकता है; इस प्रकार, दवा प्रतिरोध परीक्षण नहीं किया जा सकता है। अंतिम तीन आक्रामक परीक्षाएं हैं, लेकिन वे महंगे हैं, उच्च कौशल की आवश्यकता होती है, और रोगियों को नुकसान पहुंचाने की क्षमता होती है। इसलिए, नैदानिक अभ्यास में एच पाइलोरी को कुशलतापूर्वक समाप्त करने के लिए एच पाइलोरी का पता लगाने और दवा प्रतिरोध परीक्षण के लिए एक गैर-प्रमुख, तेजी से और एक साथ विधि बहुत महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एच पाइलोरी संक्रमण और एंटीबायोटिक प्रतिरोध का तेजी से पता लगाने के लिए मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) के साथ संयोजन में स्ट्रिंग परीक्षण को शामिल करने वाली एक विशिष्ट प्रक्रिया प्रस्तुत करना है। बैक्टीरियल संस्कृतियों के विपरीत, यह विधि एच पाइलोरी संक्रमण की स्थिति और दवा प्रतिरोध के आसान, तेजी से, गैर-आक्रामक निदान की अनुमति देती है। पाइलोरी संक्रमण और 23 एस आरआरएनए और गाइरा जीन में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए क्यूपीसीआर का उपयोग किया, जो क्रमशः क्लेरिथ्रोमाइसिन और लेवोफ़्लॉक्सासिन के खिलाफ प्रतिरोध को एन्कोड करते हैं। नियमित रूप से उपयोग की जाने वाली संवर्धन तकनीकों की तुलना में, यह प्रोटोकॉल एच पाइलोरी संक्रमण का पता लगाने और क्यूपीसीआर का उपयोग करके इसके एंटीबायोटिक प्रतिरोध को निर्धारित करने के लिए एक गैर-आक्रामक, कम लागत वाली और समय की बचत तकनीक प्रदान करता है।
Introduction
पाइलोरी एक सर्पिल आकार का, अत्यधिक गतिशील, ग्राम-नकारात्मक जीवाणु है जो मुख्य रूपसे पेट के पाइलोरस क्षेत्र में रहता है। यह एक आम रोगज़नक़ है जोवैश्विक आबादी के लगभग 50% को संक्रमित करता है। पाइलोरी संक्रमण वाले अधिकांश लोगों में कोई नैदानिक अभिव्यक्तियां नहीं होती हैं, और अधिकांश संक्रमण के कई वर्षों के बाद विभिन्न बीमारियों का विकास करते हैं, जिसमें पुरानी गैस्ट्र्रिटिस, पेप्टिक अल्सर, गैस्ट्रिक अल्सर और गैस्ट्रिक कैंसर3 शामिल हैं। विभिन्न आबादी के आधार पर कई अध्ययनों में, पेट के कैंसर और प्रीकैंसर घावों को रोकने के लिए एच पाइलोरी को खत्म करने कीप्रभावकारिता का प्रदर्शन किया गया है। इसलिए, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) इंटरनेशनल एजेंसी फॉर रिसर्च ऑन कैंसर ने एच पाइलोरी उन्मूलन को निवारक उपाय के रूप में सलाह दीहै।
पाइलोरी संक्रमण की पहचान करने के लिए गैर-आक्रामक तरीकों का उपयोग स्पर्शोन्मुख अपच वाले अधिकांश व्यक्तियों के लिए उपचार का एक प्रमुख घटक है। यूरिया सांस परीक्षण (यूबीटी), एच पाइलोरी फेकल एंटीजन टेस्ट (एसएटी), और सीरोलॉजिकल परीक्षण लोकप्रिय गैर-आक्रामक तकनीकें हैं। इनमें से, यूबीटी कम से कम घुसपैठ और सबसे सटीक प्रक्रिया उपलब्ध है। यूबीटी यूरिया का उपयोग करता है, जो एच पाइलोरी में प्रचुर मात्रा में मौजूद है, आइसोटोपिक रूप से लेबल यूरिया को अमोनिया और कार्बन डाइऑक्साइड (13 सी या 14 सी) में हाइड्रोलाइज करने के लिए। इसके विपरीत, इम्यूनोक्रोमैटोग्राफिक परख (आईसीए) 7 नमूने के लिए सुविधाजनक, सरल और गैर-प्रभावी है। हालांकि, परीक्षण की सटीकता कई कारकों से प्रभावित होती है, जैसे मल के नमूने की गुणवत्ता, तापमान और नमूना संग्रह और परीक्षण के बीच अंतराल। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के आधार पर एक अन्य परीक्षण सीरम एच पाइलोरी एंटीबॉडी परीक्षण है, जो रोगी के सीरम में एंटीबॉडी का पता लगाता है। हालांकि, यह परीक्षण उपचार के बाद के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि बैक्टीरियाको साफ करने के बाद एंटीबॉडी लंबे समय तक रहते हैं। एक और बड़ी कमी यह है कि ये विधियां केवल एच पाइलोरी संक्रमण का निदान करती हैं और संवेदनशीलता-आधारित उपचार का मार्गदर्शन करने के लिए दवा प्रतिरोध परीक्षण की अनुमति नहीं देती हैं।
आक्रामक परीक्षण विधियों के लिए, गैस्ट्रिक बायोप्सी ऊतक को एंडोस्कोपी द्वारा लिया जाना चाहिए और फिर हिस्टोलॉजी, यूरिया रैपिड टेस्ट और बैक्टीरियल कल्चर के अधीन किया जाना चाहिए। ये परीक्षण विधियां भी कई कारकों के कारण बहुत सीमित हैं। वर्तमान में, ये तकनीक बुजुर्ग रोगियों, प्रीकैंसरस या घातक बीमारी के लिए उच्च जोखिम वाले रोगियों और गैस्ट्रोओसोफेगल रिफ्लक्स रोग या एच पाइलोरी संक्रमण9 के लिए पहली पंक्ति की चिकित्सा में विफल रहे रोगियों तक सीमित हैं। पाइलोरी की अनूठी विकास विशेषताओं के कारण, बैक्टीरिया संस्कृति की सफलता दर केवल 50% 10 तक पहुंचती है। इस प्रकार, आणविक पहचान विधियां आक्रामक पहचान विधियों की उच्च मांगों को दूर करने और संवेदनशीलता-आधारित उपचार का मार्गदर्शन करने के लिए नई आशा प्रदान करती हैं। आणविक पहचान विधियों के बीच, मात्रात्मक पीसीआर हाल के वर्षों में काफी विकसित हुआ है। क्यूपीसीआर, पारंपरिक पीसीआर के विपरीत, जेल वैद्युतकणसंचलन की आवश्यकता नहीं होती है और एनीलिंग चरण में प्राइमर और जांच जोड़कर नमूनों में डीएनए / आरएनए को सटीक रूप से निर्धारित करता है। पाइलोरी संक्रमण और दवा प्रतिरोध का पता लगाने के लिए क्यूपीसीआर किट अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। फिर भी, प्रत्येक विधि की अपनी सीमाएं हैं; इसलिए, एक रोगी के नैदानिक निदान और उपचार को उनके लक्षणों, संकेतों, इतिहास, अन्य प्रयोगशाला परीक्षणों और उपचार की प्रतिक्रिया के साथ संयोजन के रूप में माना जाना चाहिए।
वर्तमान में, एच.पाइलोरी संक्रमण के इलाज की प्राथमिक विधि एंटीबायोटिक्स ले रही है, लेकिन हाल ही में, एंटीबायोटिक प्रतिरोध में वृद्धि के कारण इन संक्रमणों का इलाज करना मुश्किल होता जा रहा है। इसके बाद, विश्व स्तर पर एच पाइलोरी उपचार प्रभावकारिता में उल्लेखनीय गिरावट देखी गई है, जिससे एच पाइलोरी उन्मूलन एक प्रमुख सार्वजनिकस्वास्थ्य मुद्दा बन गया है।
क्लैरिथ्रोमाइसिन और लेवोफ़्लॉक्सासिन दो व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक्स हैं जिनका उपयोग एच.पाइलोरी के कारण होने वाले संक्रमण के इलाज के लिए किया जाता है, लेकिन कई अध्ययनों ने एच.पाइलोरी आइसोलेट्स में इन दो दवाओं के खिलाफ व्यापक प्रतिरोध की सूचना दी है। ए 2143 जी, ए 2142 जी, और ए 2142 सी 2.9 केबी 23 एस आरआरएनए जीन में पाए जाने वाले कई बिंदु उत्परिवर्तनों में से तीन हैं जिनके परिणामस्वरूप मैक्रोलाइड को बंधन से रोककर क्लैरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध होता है। इसी समय, लिवोफ़्लॉक्सासिन प्रतिरोध जीन के उत्परिवर्तन लोकी मुख्य रूप से गाइरा जीन12 के छह उत्परिवर्तन साइटों (ए 260 टी, सी 261 ए, टी 261 जी, जी 271 ए, जी 271 टी, ए 272 जी) में स्थित हैं। आनुवंशिक उत्परिवर्तन के आधार पर इन प्रतिरोध तंत्रों की खोज ने आणविक परीक्षण के लिए सांस्कृतिक-आधारित अध्ययनों के माध्यम से एच पाइलोरी का पता लगाने में क्रमिक बदलाव किया है।
कुल मिलाकर, एच पाइलोरी संक्रमण और दवा प्रतिरोध का पता लगाने के लिए एक गैर-प्रमुख, प्रभावी और एक साथ नैदानिक विधि की तत्काल नैदानिक आवश्यकता है। हमने नमूनाकरण की कठिनाइयों को दूर करने और विभिन्न प्राइमर जांच का उपयोग करके एच पाइलोरी संक्रमण और दवा प्रतिरोध का एक साथ पता लगाने के लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक संयुक्त स्ट्रिंग परीक्षण और क्यूपीसीआर विधि अपनाई।
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Protocol
वर्तमान अध्ययन गुआंग्डोंग प्रांतीय पीपुल्स अस्पताल, दक्षिणी चिकित्सा विश्वविद्यालय, गुआंगज़ौ, चीन की नैतिक समिति द्वारा स्थापित नैतिक विचारों के अनुरूप आयोजित किया गया था (अनुमोदन संख्या: केवाई-क्यू-2022-384-02)। इस अध्ययन में 18-60 वर्ष की आयु सीमा के रोगियों को शामिल किया गया था। परीक्षण से पहले 2 सप्ताह के भीतर एंटीबायोटिक्स, जीवाणुरोधी चीनी दवाएं, प्रोटॉन पंप इनहिबिटर (पीपीआई), या एच2 रिसेप्टर विरोधी आदि जैसी दवाएं लेने वाले रोगियों को इस अध्ययन में शामिल नहीं किया गया था। उन रोगियों को जिन्होंने पिछले 3 महीनों में एच.पाइलोरी के खिलाफ उपचार प्राप्त किया था, उन्हें भी इस अध्ययन से बाहर रखा गया था। गंभीर हृदय, यकृत, गुर्दे की समस्याओं, गंभीर न्यूरोपैथी, या मानसिक बीमारी वाले लोगों को भी इस अध्ययन में भाग लेने की अनुमति नहीं थी। इस अध्ययन में शामिल कोई गर्भवती महिला और स्तनपान कराने वाली माताएं नहीं थीं। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली आपूर्ति (अभिकर्मकों, रसायनों, उपकरण और सॉफ्टवेयर) का विवरण सामग्री की तालिका में दिया गया है।
1. गैस्ट्रिक द्रव नमूनाकरण के लिए स्ट्रिंग परीक्षण
- नमूना संग्रह से पहले रोगी को रात भर उपवास करने के लिए कहें।
- अगले दिन, स्ट्रिंग टेस्ट किट खोलें, कैप्सूल लें, और स्ट्रिंग के अंत में लूप पकड़ें।
- रोगी के गाल पर स्ट्रिंग टेप करें, और उन्हें गले के पीछे अपनी जीभ पर कैप्सूल रखने के लिए कहें और इसे पानी के घूंट के साथ निगल लें।
- कैप्सूल को रोगी के पेट में भंग करने की अनुमति दें, इस प्रकार गैस्ट्रिक बलगम को अवशोषित करने के लिए कैप्सूल के भीतर स्ट्रिंग को उजागर करें।
- एक प्रशिक्षित सहायक से कहें कि वह रोगी द्वारा कैप्सूल निगलने के 1 घंटे बाद स्ट्रिंग को सावधानीपूर्वक बाहर निकाले।
- गैस्ट्रिक द्रव में भिगोए गए स्ट्रिंग (40 सेमी) के निचले छोर को काट लें, इसे टीएसई (ट्रिस / सलाइन / ईडीटीए) नमूना संरक्षण समाधान में रखें, और फिर इसे एच पाइलोरी का पता लगाने और क्यूपीसीआर का उपयोग करके एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रोफाइल के निर्धारण के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर नैदानिक प्रयोगशाला में भेजें।
2. डीएनए निष्कर्षण
- नमूना ले जाने वाले संग्रह ट्यूबों को एक टेस्ट ट्यूब रैक पर रखें, ठीक से लेबल करें, और उन्हें 10 सेकंड के लिए भंवर करें।
- चुंबकीय मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए 32-वेल प्लेट (न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण या शुद्धि किट) को कई बार उल्टा करें। 10 सेकंड के लिए एक छोटे भंवर के बाद, प्लेट से एल्यूमीनियम पन्नी सीलिंग को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- प्रत्येक नमूने से गैस्ट्रिक द्रव के 200 μL और H. pylori DNA को अलग-अलग कुओं में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में स्थानांतरित करें।
- स्वचालित डीएनए निष्कर्षण के लिए न्यूक्लिक एसिड एक्सट्रैक्टर मशीन के संबंधित नमूना स्लॉट में 32-वेल प्लेट रखें।
- डीएनए निष्कर्षण और पुष्टि के बाद, सकारात्मक नमूनों पर क्यूपीसीआर के माध्यम से क्लैरिथ्रोमाइसिन और लेवोफ़्लॉक्सासिन के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध परीक्षण शुरू करें।
- दीर्घकालिक भंडारण और भविष्य के उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर अत्यधिक गैस्ट्रिक द्रव और निकाले गए डीएनए नमूने रखें।
- किसी भी संदूषण से बचने के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में इन सभी चरणों का पालन करें।
पाइलोरी का पता लगाने और एंटीबायोटिक दवाओं (क्लेरिथ्रोमाइसिन और लेवोफ़्लॉक्सासिन) के प्रतिरोध के लिए क्यूपीसीआर
- पाइलोरी और इसके जीनोम में संदिग्ध एंटीबायोटिक प्रतिरोध उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए क्यूपीसीआर करें।
- क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण (एच पाइलोरी न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन किट) को बर्फ पर पिघलाएं, और अभिकर्मक के किसी भी नुकसान को रोकने के लिए इसे फ्लिक और स्पिनिंग द्वारा मिलाएं।
- 32-वेल प्लेट पर प्रत्येक नमूने के लिए, पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के 20 μL (जीनोटाइपिंग रिएक्शन प्रीमिक्स [टैक एंजाइम, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिओसाइड ट्राइफॉस्फेट, रिएक्शन बफर और मैग्नीशियम क्लोराइड युक्त], यूआरईए फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर, और एक यूरिया जांच, और निकाले गए डीएनए के 5 μL मिलाएं।
- क्यूपीसीआर मशीन पर 32-वेल क्यूपीसीआर प्लेट चलाएं। थर्मल साइकलर को प्रोग्राम करें: प्रतिक्रिया मिश्रण को पहले 2 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस (दोनों एक चक्र के लिए) पर क्रमिक रूप से प्रतिक्रिया की जाएगी; फिर, 95 डिग्री सेल्सियस पर 40 चक्र, 10 एस के लिए विकृतीकरण, और 45 एस के लिए 58 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग और विस्तार।
- फ्लोरेसेंस सिग्नल अधिग्रहण को एफएएम (एच पाइलोरी) और डेटा अधिग्रहण को प्रवर्धन विस्तार अवधि में सेट करें। प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद, डेटा को भविष्य के परिणाम विश्लेषण के लिए सहेजें।
- क्यूपीसीआर के लिए विशिष्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें, क्योंकि उपकरण स्वचालित रूप से बेसलाइन थ्रेसहोल्ड का चयन करेगा।
- यदि एच पाइलोरी के लिए परीक्षण परिणाम सकारात्मक है, तो मशीन स्वचालित रूप से नमूने पर दवा प्रतिरोध परीक्षण शुरू कर देगी। एच पाइलोरी (क्यूपीसीआर) किट में 23 एस आरआरएनए जीन और गाइरा जीन उत्परिवर्तन के लिए डिटेक्शन अभिकर्मकों के साथ अभिकर्मक किट को बदलें।
नोट: अभिकर्मक किट (हेलिकोबैक्टर पाइलोरी [क्यूपीसीआर] में 23 एस आरआरएनए जीन और गाइरा जीन उत्परिवर्तन के लिए पहचान अभिकर्मक) में पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण (जीनोटाइपिंग प्रतिक्रिया प्रीमिक्स [टैक एंजाइम, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट, प्रतिक्रिया बफर, मैग्नीशियम क्लोराइड), प्राइमर और जांच शामिल हैं। सभी नकारात्मक गुणवत्ता नियंत्रण उत्पाद बाँझ, शुद्ध पानी हैं। पाइलोरी न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन किट में सकारात्मक गुणवत्ता नियंत्रण उत्पाद निष्क्रिय एच पाइलोरी मानक मोती (एटीसीसी 43504) है। किट में मजबूत एच पाइलोरी-पॉजिटिव और कमजोर सकारात्मक गुणवत्ता नियंत्रण उत्पाद (एच पाइलोरी में 23 एस आरआरएनए जीन और गाइरा जीन उत्परिवर्तन के लिए पहचान अभिकर्मक) निष्क्रिय एच पाइलोरी स्ट्रेन के डीएनए हैं जिनमें लक्ष्य जीन और उत्परिवर्ती जीन होते हैं। इसी तरह, वास्तविक स्थिति के आधार पर, एच पाइलोरी संक्रमण या दवा प्रतिरोध की उपस्थिति सहित सभी नैदानिक मानक, सीटी ≤ 35 पर सेट हैं और एक विशिष्ट एस-आकार का वक्र है। कमजोर गुणवत्ता नियंत्रण की एकाग्रता 1.0 x 103 प्रतियां / एमएल है, जबकि मजबूत गुणवत्ता नियंत्रण की एकाग्रता 1.0 x 108 प्रतियां / एमएल है।
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Representative Results
क्यूपीसीआर द्वारा पेट के तरल पदार्थ में एच पाइलोरी संक्रमण और एंटीबायोटिक प्रतिरोध का पता लगाना
पाइलोरी संक्रमण का पता लगाने के लिए हमने यूरेए जीन को बढ़ाकर क्यूपीसीआर का प्रदर्शन किया और 23 एस आरआरएनए जीन और गाइरा जीन (तालिका 1) में बिंदु उत्परिवर्तन को लक्षित करके इसकी एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रोफ़ाइल निर्धारित की। क्यूपीसीआर प्रयोगों के सभी तीन समूहों में गुणवत्ता नियंत्रण सीटी मान अनुशंसित सीमा के भीतर थे, यह दर्शाता है कि प्रयोग के समय नमूने सभी सामान्य स्थिति में थे और परीक्षण के परिणाम विश्वसनीय थे। इस अध्ययन में, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता को चिह्नित करने के लिए विभिन्न परीक्षण परिणामों (एस 1-एस 5) के साथ पांच नमूने चुने गए थे। एस 1 संक्रमण के बिना एच पाइलोरी के प्रतिनिधि तनाव का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि एस 2-एस 5 नमूने विभिन्न प्रतिरोध परिणामों के साथ एच पाइलोरी से संक्रमित हैं (चित्रा 1)। पाइलोरी से संक्रमित नहीं होने वाले नमूनों के साथ आगे प्रतिरोध परीक्षण नहीं करने के लिए सिस्टम सेट किया, इसलिए सिस्टम परीक्षण के बाद एस 1 नमूना प्रतिरोध परीक्षण में प्रवेश नहीं किया। पाइलोरी संक्रमण के लिए सकारात्मक नमूनों के संदर्भ में, एस 2 सीटी मान सभी पहचान सीमा के भीतर थे, यह दर्शाता है कि नमूना एच पाइलोरी-पॉजिटिव था और क्लैरिथ्रोमाइसिन और लेवोफ़्लॉक्सासिन के लिए दोहरी प्रतिरोध दिखाया, और चिकित्सकों को अपने विवेक पर उपचार के लिए अन्य तरीकों का चयन करने की सिफारिश की गई थी। पाइलोरी संक्रमण और लेवोफ़्लॉक्सासिन प्रतिरोध परीक्षण के लिए एस 3 सीटी मान पहचान सीमा के भीतर थे, जबकि क्लैरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध परीक्षण में कोई सीटी मान नहीं पाया गया था, यह दर्शाता है कि एस 3 नमूना एक लेवोफ़्लॉक्सासिन-प्रतिरोधी रोगी से था। इसी तरह, एस 4 नमूने का सीटी मान एच पाइलोरी संक्रमण और क्लैरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध के लिए पहचान सीमा के भीतर था, जबकि लिवोफ़्लॉक्सासिन प्रतिरोध के लिए कोई सीटी मान नहीं पाया गया था, यह दर्शाता है कि यह रोगी क्लैरिथ्रोमाइसिन के लिए प्रतिरोधी था, और यह अनुशंसा की गई थी कि वे उपचार के लिए लेवोफ़्लॉक्सासिन लें। अंत में, एस 5 नमूना परीक्षण ने केवल एच पाइलोरी संक्रमण का पता लगाने के लिए पहचान सीमा के भीतर सीटी मान दिखाए, यह दर्शाता है कि यह रोगी दोनों एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति संवेदनशील था और दोनों दवाओं में से किसी एक का उपयोग करके इलाज किया जा सकता था। बैक्टीरियल कल्चर विधि की तुलना में, जो एच पाइलोरी संक्रमण और दवा प्रतिरोध का भी पता लगाता है, यह विधि रोगी को नुकसान पहुंचाए बिना एच पाइलोरी संक्रमण और दवा प्रतिरोध का पता लगाने में सुरक्षित और प्रभावी है और इसका उपयोग उचित उपचार योजना तैयार करने में डॉक्टर का मार्गदर्शन करने के लिए किया जा सकता है।
चित्र 1: क्यूपीसीआर द्वारा पेट के तरल पदार्थ में एच पाइलोरी और इसके एंटीबायोटिक प्रतिरोध का पता लगाना।
(ए) एच पाइलोरी संक्रमण का मात्रात्मक पीसीआर प्रवर्धन, (बी) क्लैरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध का पता लगाना, और (सी) लिवोफ़्लॉक्सासिन प्रतिरोध का पता लगाना। "एस" नमूना के लिए खड़ा है। "एस 1" एक नमूना है जो एच पाइलोरी संक्रमण के लिए नकारात्मक आया था और एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए भी परीक्षण किया गया था; पाइलोरी संक्रमित नमूना है जिसमें क्लैरिथ्रोमाइसिन और लेवोफ़्लॉक्सासिन दोनों के प्रतिरोध हैं; पाइलोरी-पॉजिटिव नमूना भी है लेकिन क्लैरिथ्रोमाइसिन-अतिसंवेदनशील और लेवोफ़्लॉक्सासिन-प्रतिरोधी है; पाइलोरी-पॉजिटिव नमूना भी है लेकिन क्लैरिथ्रोमाइसिन-प्रतिरोधी और लेवोफ़्लॉक्सासिन-अतिसंवेदनशील है; पाइलोरी-पॉजिटिव नमूना है लेकिन क्लैरिथ्रोमाइसिन और लिवोफ़्लॉक्सासिन दोनों के लिए अतिसंवेदनशील है। कमजोर गुणवत्ता नियंत्रण की एकाग्रता 1.0 x 103 प्रतियां / एमएल है, जबकि मजबूत गुणवत्ता नियंत्रण की एकाग्रता 1.0 x 108 प्रतियां / एमएल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| नमूना | एच. पाइलोरी | क्लैरिथ्रोमाइसिन | लिवोफ़्लॉक्सासिन | |||
| +/- | सीटी | +/- | सीटी | +/- | सीटी | |
| S1 | - | U | - | U | - | U |
| S2 | + | 22.61 | + | 22.77 | + | 23 |
| S3 | + | 28.32 | - | U | + | 30.18 |
| S4 | + | 28.76 | + | 27.67 | - | U |
| S5 | + | 31.59 | - | U | - | U |
तालिका 1: एच पाइलोरी संक्रमण का पता लगाने और क्लेरिथ्रोमाइसिन और लेवोफ़्लॉक्सासिन के प्रतिरोध के क्यूपीसीआर परिणामों को दिखाने वाली तालिका। पाइलोरी संक्रमण के लिए गुणात्मक परिणाम प्रस्तुत करता है, 23 एस आरआरएनए जीन उत्परिवर्तन का पता लगाने से पता चलता है कि आइसोलेट क्लैरिथ्रोमाइसिन के लिए प्रतिरोधी है, और गाइरा जीन उत्परिवर्तन का पता लगाने से पता चलता है कि आइसोलेट लिवोफ़्लॉक्सासिन के लिए प्रतिरोधी है। +/−, गुणात्मक परिणाम; +, सकारात्मक परिणाम; −, नकारात्मक परिणाम।
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Discussion
पाइलोरी का पता लगाने को आक्रामक और गैर-आक्रामकदोनों तरीकों का उपयोग करके किया जा सकता है। आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली आक्रामक तकनीकों जैसे हिस्टोपैथोलॉजी, रैपिड यूरिया टेस्ट, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), और बैक्टीरियल कल्चरिंग के लिए एंडोस्कोपी और बायोप्सी की आवश्यकता होती है। सीरोलॉजिकल परीक्षण, यूरिया सांस परीक्षण, और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) की सिफारिश गैर-आक्रामकप्रक्रियाओं के बीच की जाती है। जबकि नॉनइनवेसिव तरीके प्रदर्शन करने में आसान, किफायती और रोगियों के लिए अधिक आरामदायक हैं, अतिरिक्त परख करने के लिए एच पाइलोरी के अलगाव और संवर्धन के लिए, जैसे कि तनाव की पहचान और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण, आक्रामक परीक्षणों की आवश्यकता होती है। एंटीबायोटिक प्रतिरोध में वर्तमान वृद्धि के साथ, पहले इस्तेमाल किए गए एंटीबायोटिक्स अप्रभावी हो रहे हैं और इस प्रकार, दवा प्रतिरोधी एच पाइलोरी आइसोलेट्स के कारण संक्रमण का इलाज करने में विफल रहे हैं। इस मामले में, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण करने के लिए एच पाइलोरी को पुनः प्राप्त करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं का चयन करने की आवश्यकता हो सकती है जो सबसे अधिक संभावना प्रतिरोधी बैक्टीरिया को सफलतापूर्वक खत्म कर देगी।
नियमित रूप से आयोजित संस्कृति-आधारित संवेदनशीलता परख जैसे कि अगर कमजोर पड़ने की विधि और एप्सिलोमीटर परीक्षण (ई-टेस्ट) की कई सीमाएं हैं: वे समय लेने वाले हैं, क्योंकि एच पाइलोरी एक धीमी गति से बढ़ने वाला बैक्टीरिया है, महंगा, कौशल-आधारित है, और आक्रामक तकनीकों की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से विभिन्न आणविक-आधारित तकनीकों, जैसे कि फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश) तकनीक और क्यूपीसीआर, का उपयोग कई उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि 23 एस आरआरएनए जीन में, जो क्लैरिथ्रोमाइसिन15,16 के खिलाफ प्रतिरोध को एन्कोड करता है। पाइलोरी के 23एस आरआरएनए प्रतिरोध जीन के तीन बिंदु उत्परिवर्तन स्थलों (ए 2142 जी, ए 2143 जी, ए 2142 सी) और क्विनोलोन एंटीबायोटिक दवाओं के छह बिंदु उत्परिवर्तन साइटों (ए 260 टी, सी 261 ए, टी 261 जी, जी 271 ए, जी 271 टी, ए 272 जी) को क्रमशः क्लेरिथ्रोमाइसिन और लेवोक्सासिन के खिलाफ प्रतिरोध निर्धारित करने के लिए प्राइमर और जांच डिजाइन करने के लिए चुना गया था।
स्ट्रिंग परीक्षण, जो एंटेओ-टेस्ट से उत्पन्न हुआ है, एक अत्यधिक शोषक नायलॉन स्ट्रिंग से जुड़े कैप्सूल का उपयोग करता है, जिसे गैस्ट्रिक स्राव17 को इकट्ठा करने के लिए निगल लिया जाता है। वर्तमान में, स्ट्रिंग परीक्षणों का उपयोग तपेदिक18 का निदान करने के लिए किया गया है, पारंपरिक क्लेबसिएला निमोनिया 19 से अत्यधिक वायरल क्लेबसिएला निमोनिया (एचवीकेपी) को अलग करने के लिए, ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया और खमीर की पहचान करने के लिए, और गैस्ट्रिक द्रव20 से एच पाइलोरी का निदान करने के लिए। इस अध्ययन में, हमने एक नैदानिक सेटअप में एच पाइलोरी संक्रमण की पहचान के लिए क्यूपीसीआर के साथ स्ट्रिंग टेस्ट, एक न्यूनतम इनवेसिव तकनीक को जोड़ा और एच पाइलोरी जीनोम में पहले से रिपोर्ट किए गए प्रतिरोध-एन्कोडिंग म्यूटेशन को लक्षित करके संवेदनशीलता परीक्षण किया। हमने यूरिया जीन को चुना क्योंकि यह एच पाइलोरी के लिए अद्वितीय एक हाउसकीपिंग जीन है जिसमें अन्य जीवों के साथ क्रॉस-रिएक्शन का कोई संभावित जोखिम नहीं है। पाइलोरी आइसोलेट्स में मानव पेट में जीवित रहने के लिए यूरेए जीन होना चाहिए, और नॉक-आउट प्रयोगों से पता चला है कि यूरिया जीन के बिना एच पाइलोरी में पेट में उपनिवेश करने की क्षमता नहीं है।
क्यूपीसीआर के लिए, गुणवत्ता नियंत्रण मानक बेहद महत्वपूर्ण हैं। पाइलोरी के क्यूपीसीआर डिटेक्शन में, गुणवत्ता नियंत्रण मानकों की आवश्यकताएं निम्नानुसार हैं: एक नकारात्मक गुणवत्ता नियंत्रण उत्पाद (एफएएम डिटेक्शन मार्ग में प्रतिदीप्ति संकेत में कोई वृद्धि नहीं, कोई विशिष्ट एस-प्रकार प्रवर्धन वक्र नहीं, सीटी मान 35.00 > या कोई स्पष्ट संकेत नहीं); एक सकारात्मक गुणवत्ता नियंत्रण उत्पाद (एफएएम डिटेक्शन मार्ग का प्रतिदीप्ति संकेत विकास वक्र जो एस-आकार के वक्र को दर्शाता है, सीटी मान 35.00 ≤), और उपरोक्त आवश्यकताओं को एक साथ पूरा किया जाना चाहिए; अन्यथा, परीक्षण को अमान्य माना जाएगा और इसे फिर से आयोजित करने की आवश्यकता होगी। पाइलोरी प्रतिरोध के क्यूपीसीआर का पता लगाने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं (क्लैरिथ्रोमाइसिन और लेवोफ़्लॉक्सासिन) के लिए सीटी, सीटी मान को छोड़कर जो सकारात्मक और नकारात्मक परिणामों के बीच अंतर करता है, जो प्रतिरोध का पता लगाने के लिए 30.00 तक बदल जाता है, अन्य आवश्यकताएं ऊपर के समान हैं। विशेष रूप से, प्राइमरों और जांच के बारे में अनुक्रम जानकारी इस पेपर में अनुपलब्ध है क्योंकि इसमें वाणिज्यिक संपत्ति के अधिकार शामिल हैं।
प्रत्येक रोगी के लिए अधिक कुशल एंटीबायोटिक दवाओं का चयन करने के लिए, विश्व स्तर पर बढ़ते रोगाणुरोधी प्रतिरोध के कारण एच. पाइलोरी के स्थानीय प्रसार और इसके एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रोफाइल का सर्वेक्षण करना महत्वपूर्ण है और इसके अतिरिक्त, विभिन्न भौगोलिक क्षेत्रों के बीच प्रतिरोध पैटर्न में भिन्नता के कारण। हमारे अध्ययन की प्रमुख सीमा यह है कि नमूना आकार बहुत छोटा था और एच पाइलोरी संक्रमण और इसके पूर्ण एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रोफ़ाइल के प्रसार को दिखाने के लिए चीन में विभिन्न भौगोलिक क्षेत्रों को कवर नहीं किया गया था, लेकिन स्ट्रिंग परीक्षण तकनीक अच्छी तरह से विकसित है, और इसे क्यूपीसीआर के साथ जोड़कर, हमने एच पाइलोरी का एक साथ निदान प्राप्त किया । संक्रमण और दवा प्रतिरोध का पता लगाना। इन परिणामों से पता चलता है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग दुनिया के विभिन्न क्षेत्रों में बड़े पैमाने पर किया जा सकता है।
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Disclosures
कोई नहीं।
Acknowledgments
इस काम को शेन्ज़ेन में सनमिंग प्रोजेक्ट ऑफ मेडिसिन द्वारा समर्थित किया गया था (ग्रांट नंबर 1)। SZSM201510050) और गुआंग्डोंग बेसिक एंड एप्लाइड बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2022 ए 1515220023)। गुआनडोंग प्रांतीय पीपुल्स अस्पताल के उन्नत प्रतिभाओं के लिए रिसर्च फाउंडेशन (सं। KJ012021097), और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81871734, 82072380, 82272423)। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में फंड की कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
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