Dieses Video zeigt Techniken für die Kennzeichnung von menschlichen embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Technik kann für eine in vivo Verfolgung der transplantierten Stammzellen mit optischen Bildgebung und zur histopathologischen Korrelation mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden.
Optical Imaging (OI) ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Werkzeug zur In-vivo-Überwachung der neuen Stammzell-basierten Therapien. Die Technik basiert auf ex vivo-Markierung von Stammzellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff, anschließende intravenöse Injektion der markierten Zellen und Visualisierung ihrer Anreicherung in bestimmten Zielorganen oder Pathologien basiert. Die vorgestellte Technik zeigt, wie wir von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) Etikett durch einfache Inkubation mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff DiD (C67H103CIN2O3S) und wie wir humanen embryonalen Stammzellen (hES) Etikett mit der FDA zugelassen Fluoreszenzfarbstoff Indocyaningrün (ICG). Die Aufnahme-Mechanismus erfolgt über die Einhaltung und Verbreitung der lipophilen Farbstoff in die Phospholipid-Doppelschicht der Zellmembran. Die Kennzeichnung Effizienz ist in der Regel verbessert werden, wenn die Zellen mit dem Farbstoff in serum-freien Medien als der Inkubation in Serum-haltigen Medien Gegensatz bebrütet werden. Darüber hinaus ist der Zusatz des Transfektionsagens Protaminsulfat deutlich verbessert Kontrastmittelaufnahme.
OI ist ein relativ neues bildgebendes Verfahren, basierend auf der Detektion von Fluoreszenz. OI ist so sensibel wie Radiotracer-basierten Imaging-Techniken, aber nicht mit einer Bestrahlung Exposition verbunden. OI stellt ein wirksames Mittel zur Verfolgung Zellen nicht-invasiv und wiederholt damit einen Einblick in die Zellwanderung an den Zielort. Eine wichtige Einschränkung der Technik ist die begrenzte Eindringen in das Gewebe von fluoreszierenden Sonden in vivo. So ein Tracer Akkumulation im tiefen Gewebe, mehr als etwa 5-10 cm von d…
Dieses Projekt wurde von einem Leon J. Thal SEED Zuschuss aus dem California Institute for Regenerative Medicine unterstützt. Tobias Henning wurde durch eine Forschung von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HE 4578/1-2) Stipendium finanziert. Wir wollen danken Juanito Meneses für seine Beratung auf die Kultur von humanen embryonalen Stammzellen.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
DMSO | Reagent | Sigma | D-2650 | |
D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma | D5648 | |
Gelatin | Reagent | Sigma | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO | 14190-144 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Falcon | 352340 | |
DiD | Reagent | Molecular Probes | V-22887 | |
Knockout DMEM | Reagent | GIBCO | 10829018 | |
Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO | 10828028 | |
b-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | 7522 | |
Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO | 11140050 | |
FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO | 25030081 | |
Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO | 15140-122 | |
Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners Inc. |