Summary
Com o crescente interesse em terapias com células-tronco, técnicas de imagem molecular são ideais para monitorar o comportamento de células-tronco após o transplante. Genes repórter luciferase permitiram não-invasivo de avaliação, repetitiva de sobrevivência da célula, localização e proliferação in vivo. Este vídeo vai demonstrar como controlar a proliferação CTEh em um rato vivo.
Abstract
A descoberta de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) aumentou drasticamente as ferramentas disponíveis para cientistas médicos interessados em medicina regenerativa. No entanto, a injeção direta de hESCs e células diferenciadas de hESCs, em organismos vivos até agora tem sido dificultada pela morte celular significativa, a formação de teratoma, e rejeição imune do hospedeiro. Compreensão do comportamento em CTEh vivo após o transplante exige técnicas de imagem inovadora para monitorar longitudinalmente localização CTEh, proliferação e viabilidade. A imagem molecular tem dado investigadores um meio de alto rendimento, baixo custo, e sensível para o rastreamento na proliferação celular vivo ao longo de dias, semanas e até meses. Este avanço tem aumentado significativamente a compreensão da cinética espaço-temporal de enxerto CTEh, proliferação e formação de teratoma, nos indivíduos que vivem.
Um grande avanço em imagem molecular tem sido a extensão dos ensaios não-invasivo gene repórter da biologia molecular e celular em plataformas in vivo modalidade multi-imagem. Estes genes repórter, sob controle de promotores e potenciadores de engenharia que se aproveitam da maquinaria transcricional da célula hospedeira s, são introduzidas nas células usando uma variedade de métodos de vetor e vetor não. Uma vez na célula, genes repórter pode ser transcrita ou constitutivamente ou apenas sob determinadas condições biológicas ou celular, dependendo do tipo de promotor usado. Transcrição e tradução de genes repórter em proteínas bioativas é detectada com instrumentação, sensível não-invasiva (por exemplo, câmeras CCD) usando o sinal de geração de sondas, tais como D-luciferina.
Para evitar a necessidade de luz de excitação para rastrear as células-tronco in vivo como é necessário para imagens de fluorescência, bioluminescência repórter sistemas de imagem gene exigem apenas uma sonda exogenamente administrada para induzir a emissão de luz. Firefly luciferase, derivado do Photinus firefly pyralis, codifica uma enzima que catalisa D-luciferina ao opticamente metabólito ativo, oxiluciferina. Atividade óptica pode ser monitorada com uma câmera CCD externa. Estavelmente transduzidas células que carregam o repórter construir dentro de seu DNA cromossômico vai passar o repórter construção de DNA para as células filhas, que permitam um acompanhamento longitudinal de sobrevivência e proliferação CTEh in vivo. Além disso, como expressão do produto do gene repórter é necessário para a geração do sinal, apenas as células viáveis pai e filha vai criar sinal de bioluminescência; células apoptóticas ou morto, não.
Neste vídeo, os materiais e métodos específicos necessários para a proliferação de rastreamento de células-tronco e formação de teratoma com a imagem de bioluminescência será descrito.
Protocol
- Construção de Gene Double Fusion Reporter
- A fim de realizar imagem de bioluminescência de células estaminais embrionárias humanas, é preciso primeiro obter células que expressam de forma estável um gene repórter luciferase, como vaga-lume luciferase dirigido por um promotor constitutivo como Ubiquitina ou EF1a.
- O foco deste protocolo é em aplicações gene repórter, então os procedimentos detalhados não são fornecidos aqui. No entanto, a estratégia geral do nosso laboratório é usar um vetor de construção de dupla fusão que contém firefly luciferase (flutuações) e proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) separados por um espaçador dentro pCDNA 3.1 +.
- Resumidamente, o nosso gene de fusão dupla foi originalmente localizada a jusante do promotor citomegalovírus em pCDNA 3.1 (+), de modo que o fragmento foi retirado 3,3 kbp usando NdeI e NotI digestão e finais blunt ligada no sítio múltiplo de clonagem de uma auto-inativação SIN ( ) vector lentiviral, sob controle de um promotor da ubiquitina.
- Transdução lentiviral
- hESCs pode ser transduzidas 3-5 dias após a passagem de uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 (título viral de cerca de 107 incubadas com 106 células).
- O estoque viral descongeladas podem ser adicionados diretamente à mídia CTEh fresco.
- Atualizar o media 12 e 24 horas depois.
- Após 48 h, a eficiência de transdução pode avaliados qualitativamente por meio de microscopia de fluorescência. Posteriormente, FACS pode ser usada para isolar as células infectadas.
- HESCs cultura e Introdução à Imagem Set-up
- Cultura da sua luciferase hESCs positiva no alimentador sem condições. Normalmente, seguir o protocolo WiCell padrão e utilizar placas de 6 poços revestida em fator de crescimento reduzida Matrigel, usando meios condicionados ou comercial, alimentador de mídia livre.
- De detectar as células luciferase positivo, você precisará ter a sonda repórter D-luciferina já preparado. Para fazer isso luciferina alíquota, em mL 1-1,5 preparações numa concentração final de 45 mg / mL. Manter as alíquotas a -20 ° C, quando não em uso e evitar a exposição à luz, cobrindo com toalha de papel quando não estiver em armazenamento.
- Para visualizar as células luciferase positivo, usamos IVIS 50 e 200 IVIS Imaging Systems (Xenogen Corporation, Alameda, CA). Este último sistema inclui um aparelho integrado isoflourane e câmara de indução para a anestesia temporária de pequenos animais.
- Na geração de imagens vitro bioluminescência de hESCs
- In vitro para a imagem de bioluminescência, é importante manter condições estéreis. Portanto, o sistema de imagem deve ser estéril, de preferência em uma sala de cultura celular.
- Antes de imagem, remova a mídia de células e adicionar PBS suficiente apenas para cobrir as células. Por exemplo, adicione 1 mL de PBS a cada poço de uma placa de 6 poços contendo o seu CTEh culturas.
- A proporção de D-Luciferina a PBS deve ser 1:100, então adicionar 10 mL de descongelado D-Luciferina a cada poço da placa de 6 poços.
- Espere um minuto, em seguida, tomar uma imagem usando um tempo de exposição de um segundo. Se o sinal é fraco, aumentar o intervalo de exposição e tente novamente.
- O sinal bioluminescente reflete o número de células, por isso os ensaios de quantificação pode ser realizada sinal de que se correlacionam com os números de celulares diferentes.
- Preparação de rato e células injetando para in vivo de imagens
- Gene repórter de imagem fornece um método de alto rendimento, barato e sensível para rastreamento de células após o transplante ao longo de dias, semanas e até meses. Isto é especialmente importante uma vez que as células-tronco transplantadas freqüentemente formam teratomas, são rejeitadas pelo sistema imunológico do hospedeiro, ou simplesmente morrer.
- O método mais simples para geração de imagens a formação de teratoma in vivo é injetar hESCs que expressam o gene repórter luciferase vagalume para as costas de camundongos SCID e adquirir imagens bioluminescentes com o sistema IVIS.
- Quando você está pronto para o transplante de células, use dispase ou colagenase para soltar as células, lave várias vezes, e suspendê-las em uma mistura 1:1 de fator de crescimento reduzido Matrigel e DMEM. Normalmente nós primeiro mix as células com DMEM refrigerados e depois adicionar no Matrigel. Para cada local de injeção subcutânea, injetamos 200.000 células suspensas em um volume 5-10 ul da mistura matrigel / DMEM. O número de células pode ser ajustada dependendo da sua aplicação. Lembre-se de manter tudo em gelo antes da injeção.
- Uma vez que as células estão prontas, anestesiar o rato, colocando-o na caixa de indução com isoflurano fluxo ligado. Depois de 1-5 minutos, o mouse está dormindo e pode ser colocado na mesa de operação contínua com isoflurano.
- Porque pele naturalmente auto-fluorescente e pode obscurecer a imagem de bioluminescência, teremos de remover o cabelo do lado de trás do mouse. A maneira mais fácil de fazer isso é usar um barbeador elétrico, mas você também pode usar depilação-géis. Limpe com álcool para esterilizara pele depois
- Em seguida, elaborar a sua suspensão de células em uma seringa. 23-27 agulhas funcionam melhor que elas não irão entupir com as células. Se a agulha é muito grande (<23 gauge) no trato agulha pode deixar um grande buraco através do qual as células podem vazar para fora.
- Injetar as células sob a pele em volta do mouse. Porque a pele é bem solta, use o polegar eo indicador para comprimir e estender a área que deseja injetar. Injetar sob a pele, tomando cuidado para não perfurar muito profundamente. Além disso, tente manter a agulha deslizando para fora do local de injecção enquanto pressiona o êmbolo: isso vai impedir a criação de um buraco na pele através do qual as células podem vazar se você tentar injetar novamente.
- Depois que as células são injetadas, esperar algumas horas para permitir que o mouse para acordar e correr ao redor antes de voltar a anestesiar a imagem de bioluminescência. Fazê-lo evita toxicidade isoflurano.
- Em imagem de bioluminescência vivo de células transplantadas
- Para imagens de toda a bioluminescência de animais, fazemos uma injeção intraperitoneal de D-luciferina em 375 peso corporal mg / kg. Pesar o animal para calcular a dose antes da injeção.
- Injetar o D-luciferina no peritônio, ao largo da linha média. Tenha cuidado para não ir muito fundo ou você pode danificar os órgãos internos. Se o rato começa a acordar, coloque-o novamente na caixa de knockout e esperar um minuto ou dois. Para camundongos, a bioluminescência máximo ocorre geralmente 15-40 minutos após a injeção.
- Lembre-se de colocar papel preto fosco na caixa de imagem para ajudar a absorver toda a luz não é emitida pela hESCs. Posicione o mouse (até backside) na câmara de imagem com isoflurano, em cima do papel preto. Comece com um tempo de exposição de 10 segundos. Se o sinal é saturado, tente diminuir o tempo de exposição, se demasiado fraco, aumentar a exposição.
- Uma vez que o tempo de exposição do sinal foi otimizado para o seu mouse, as imagens começam a tomar a cada minuto até que o sinal atinge um máximo. Este é o melhor feito usando o software de imagem para selecionar "regiões de interesse (ROI)", que cobrem seus locais de injecção. Ao monitorar a intensidade do sinal em cada ROI você pode facilmente determinar quando o sinal começa a diminuir, indicando que a intensidade máxima do sinal foi atingido. A máxima do sinal deve ser utilizado como seus dados final.
- Quando estiver satisfeito com suas imagens, remova o mouse de isoflurano e permitir que ele acorda em sua gaiola. Normalmente, o mouse deve acordar em 15 minutos.
- Bioluminescência imagem gene repórter pode ser repetida diariamente, semanalmente e mensalmente durante o tempo que o hESCs sobreviver no animal. Sinal de um teratoma desenvolvimento irá aumentar exponencialmente ao longo do tempo, tipicamente da ordem de semanas, como o hESCs começam a proliferar.
- Após o curso de tempo desejado de imagens bioluminescência é adquirido, o animal pode ser sacrificado e secções de tecido usado para histologia.
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Discussion
Em comparação com outras modalidades, tais como PET e RM, a bioluminescência tem resolução espacial limitada penetração nos tecidos e reduzido devido à energia relativamente fraca de fótons emitidos (2-3 eV); por estas razões que até agora não foi aplicável em animais de grande porte. No entanto, a bioluminescência tem a vantagem de ser de baixo custo, alto rendimento, e não-invasivo, tornando-se altamente desejável para in vivo com células-tronco de rastreamento em pequenos animais. Genes não bioluminescência-repórter, como construções de PET e de fluorescência pode ser utilizado em conjunto com luciferase para criar um gene repórter de fusão que é composto de diferentes domínios que contêm os genes repórter individual. Por exemplo, o nosso grupo usa uma fusão construir contendo flutuações, proteína monomérica vermelha fluorescente (MRFP) e vírus herpes simplex truncado timidina quinase (ttk, um gene repórter PET) para multi-modalidade de monitoramento do comportamento de células-tronco em pequenos animais. Ao longo do tempo, genes repórter estavelmente integrado pode estar sujeito ao silenciamento de genes pela maquinaria endógena cromossômicas. A suscetibilidade do gene repórter de silenciamento de genes está intimamente relacionada com a escolha do promotor dirigindo sua expressão. Por exemplo, o promotor de citomegalovírus (pCMV) é rapidamente silenciada em hESCs. Nosso laboratório tem tido um bom sucesso com o promotor da ubiquitina-C humano (púbica) para dirigir a expressão de uma fusão dupla construir em múltiplas linhagens celulares, CTEh, e observaram a perda de sinal mínima ao longo do tempo.
Em conclusão, antes CTEh derivados de regeneração celular torna-se clinicamente relevante, várias barreiras biológicas básicas devem ser superados - ou seja, a morte celular ou apoptose após o transplante de células diferenciadas, a formação de teratoma de células indiferenciadas, e pela rejeição imunológica do organismo hospedeiro. Esses e outros desafios destacam a necessidade de enxerto CTEh rastreamento, sobrevivência e proliferação no organismo receptor. O desenvolvimento de técnicas de imagem molecular, como o gene repórter luciferase firefly e câmeras CCD ultra-sensível permitiu não-invasivo de avaliação, repetitiva de localização celular, migração, proliferação e diferenciação in vivo. Tecnologias como estas ajudarão tradução toque de biologia CTEh do laboratório para aplicações clínicas.
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Acknowledgments
Graças a Tim Doyle, PhD e do Centro de Stanford para In Vivo Imaging para assistência com a imagem de bioluminescência. Também graças à Ngan Huang, PhD para compartilhar sua técnica sobre células-tronco co-injeção com uma solução matriz. Por último, graças a Steve Felt, Ph.D. de assistência com cuidados animais veterinária.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Hyclone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | Stem Cell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth International, Inc | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | Techno Plastic Products | 92006 |
References
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