Это видео демонстрирует протокол для метилированной иммунопреципитации ДНК (MeDIP). MeDIP является двухдневной процедуры, которые селективно экстракты метилированных фрагментов ДНК из генома образцов ДНК с использованием антител со специфичностью для 5-метилцитозин (анти-5 MC).
Выявление закономерностей метилирование ДНК является обычной процедурой в изучении эпигенетика, как метилирование, как известно, оказывают значительное влияние на экспрессию генов, и участвует с нормальным развитием, а также болезни<sup> 1-4</sup>. Таким образом, способность различать метилированной ДНК и неметилированных ДНК имеет важное значение для создания профилей метилирования для таких исследований. Метилированный ДНК иммунопреципитации (MeDIP) является эффективным инструментом для извлечения метилированной ДНК из образца интерес<sup> 5-7</sup>. Образец всего за 200 нг ДНК достаточно для антитела или иммунопреципитации (IP), реакции. ДНК ультразвуком на фрагменты размером от 300-1000 б.п., и разделен на иммунопреципитации (IP) и ввода (IN) порциями. IP ДНК впоследствии тепла денатурированного и затем инкубировали с анти-5'mC, позволяя моноклональных антител связываться метилированную ДНК. После этого, магнитных гранул содержащих вторичные антитела с сродством к первичным антителом добавляются, и инкубировали. Эти бусины-связанными антителами будет связывать моноклональные антитела, используемые в первом шаге. ДНК связана с антителом комплекс (метилированной ДНК) отделен от остальной части ДНК, используя магнит тянуть комплексов из раствора. Несколько моет использованием IP-буфера Затем выполняется для удаления несвязанных, не метилированную ДНК. Метилированные ДНК / антитело затем переваривают протеиназы К переварить антитела, оставляя только метилированную ДНК нетронутой. ДНК, обогащенной очищают фенол: хлороформ добычи для удаления белка вещества и затем осаждаются и ресуспендировали в воде для дальнейшего использования. ПЦР методы могут использоваться для проверки эффективности MeDIP процедуры на основе анализа продуктов амплификации интеллектуальной собственности и В ДНК для регионов известны их недостаток и как известно, содержат метилированные последовательности. Очищенной метилированной ДНК может быть использована для локус-специфические (ПЦР) или генома (микрочипов и последовательности) метилирования исследований, и особенно полезен при использовании в сочетании с другими инструментами исследования, такие как ген профилирования выражения и массив сравнительной гибридизации генома ( CGH)<sup> 8</sup>. Дальнейшее расследование метилирование ДНК приведет к открытию новых эпигенетических цели, которая, в свою очередь, могут быть полезны в разработке новых терапевтических или прогностических инструментов исследования таких болезней, как рак, который характеризуется аберрантно метилированной ДНК<sup> 2, 4, 9-11</sup>.
Существует растущее осознание значительную роль метилирования ДНК играет в болезнь, поэтому развитие тесты для измерения этого изменения становятся все более важными 3, 12, 13. Техника MeDIP это поддается инструмент для скрининга на обоих целого генома и локус-определенного уровня <su…
Мы хотели бы поблагодарить членов Браун и Лам лабораторий для их участия в критике это видео и статьи. Работа выполнена при поддержке за счет средств от канадских институтов по исследованиям в области здравоохранения и Майкл Смит фонда исследований в области здравоохранения.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Other | Sorenson BioScience | 11510 | |
ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |