Hücresel ve Moleküler Biyolojide Temel Yöntemler

Birçok biyomedikal deney, doğru, tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak ilgili veriler elde etmek için bilinen miktarda hücrenin manipülasyonunu gerektirir. Bu nedenle, hücrelerin nasıl sayılacağını öğrenmek, başarılı bir biyomedikal bilim adamı için özellikle önemli bir tekniktir. Hücreleri saymanın en yaygın yolu, basit bir ışık mikroskobu altında bir alikot hücresinin sayımına yardımcı olan, lazerle oyulmuş iki ızgara taşıyan bir alet olan bir hematitometre kullanmaktır. Bu veriler daha...

Hücre hatları, deneysel analiz için hücre tiplerinin hızlı bir şekilde kültürlenmesine ve genişletilmesine izin verdikleri için biyomedikal deneylerde sıklıkla kullanılır. Hücre hatları, yeni izole edilmiş veya birincil hücrelerle karşılaştırıldığında benzer koşullar altında kültürlenir, ancak bazı temel önemli farklılıklar vardır: (i) hücre hatları kendi spesifik büyüme faktörü kokteyllerine ihtiyaç duyar ve (ii) büyümeleri, birincil hücrelerden daha yakından izlenmelidir, çünkü süresiz olarak...

Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, DNA'yı termosiklasyon yoluyla amplifiye etmek için kullanılan bir tekniktir - sabit zaman aralıklarında sıcaklık değişimlerinin silles'i. Termostabil bir DNA polimeraz kullanan PCR, dNTP adı verilen DNA yapı taşlarından çok sayıda DNA kopyası oluşturabilir. PCR'de üç adım vardır: denatürasyon, tavlama ve uzama. Denatürasyon, döngünün ilk adımıdır ve bazlar arasındaki hidrojen bağlarını bozarak DNA'nın erimesine neden olur ve tek sarmallı DNA ile sonuçlanır.

DNA jel elektroforezi, DNA moleküllerinin tespiti ve ayrılması için kullanılan bir tekniktir. Agarozdan oluşan bir jel matrisine bir elektrik alanı uygulanır ve jel içinde yük parçacıkları boyuta bağlı olarak göç eder ve ayrılır. DNA omurgasının negatif yüklü fosfatları, DNA parçalarının pozitif yüklü bir elektrot olan anoda doğru hareket etmesine neden olur. Video, DNA fragmanlarının bir agaroz jeli üzerinde çözüldüğü mekanizmayı açıklar ve agaroz jellerinin nasıl hazırlanacağı, DNA...

Sodyum Dodesil Sülfat Poli-Akrilamid Jel Elektroforezi veya SDS-PAGE, protein karışımlarını boyutlarına göre ayırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Anyonik bir deterjan olan SDS, doğrusallaştırılmış proteinlerin uzunluğu boyunca eşit bir yük üretmek için kullanılır. Bunları önce poliakrilamidden yapılmış bir jele yükleyerek ve ardından jele bir elektrik alanı uygulayarak, SDS kaplı proteinler daha sonra ayrılır. Elektrik alanı, itici güç görevi görür ve SDS kaplı proteinleri anoda...

Dönüşüm, bir hücre çevresinden yabancı DNA aldığında meydana gelen süreçtir. Doğada bazı bakteri türlerinde dönüşüm meydana gelebilir. Moleküler biyolojide dönüşüm, bakteri hücre zarlarında gözeneklerin oluşturulması yoluyla laboratuvarda yapay olarak yeniden üretilir. Çevreden DNA alabilen bakteri hücrelerine yetkin hücreler denir. Laboratuvarda, bakteri hücreleri yetkin hale getirilebilir ve DNA daha sonra ısı şoku yöntemi adı verilen bir prosedürle tanıtılabilir. Isı şoku dönüşümü, plazmit...

"Dönüşüm" terimi, yabancı DNA'nın hücresel olarak yutulmasını ifade eder. Doğada, bazı bakteri türlerinde dönüşüm meydana gelebilir. Bununla birlikte, moleküler biyolojide, dönüşüm, bakteri hücre duvarlarında gözeneklerin oluşturulması yoluyla yapay olarak indüklenir. Çevreden DNA alabilen bakteri hücrelerine yetkin hücreler denir. Elektroyetkin hücreler laboratuvarda üretilebilir ve bu hücrelerin dönüşümü, hücre duvarında DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturan bir elektrik alanının...

Enzime bağlı bir immünosorbent testi (ELISA) tipik olarak, deneysel bir numune içinde ilgilenilen bir hedef proteinin varlığını ve/veya miktarını tespit etmek için gerçekleştirilir. Hedef proteinin tespiti, ELISA'yı bir immünolojik test haline getiren antikorlar tarafından mümkün kılınır. Bir dizi inkübasyon ve yıkama adımıyla, sıklıkla bir enzime bağlanan veya konjuge olan bu antikorlar, bir mikrotitre plakası üzerindeki bir kuyu dibini kaplayan proteini tespit edecektir. Bir substrata maruz...

Plazmit saflaştırma, plazmit DNA'yı genomik DNA'dan, proteinlerden, ribozomlardan ve bakteri hücre duvarından izole etmek ve saflaştırmak için kullanılan bir tekniktir. Bir plazmit, belirli DNA moleküllerinin taşıyıcısı olarak kullanılan küçük, dairesel, çift sarmallı bir DNA'dır. Transformasyon yoluyla bir konakçı organizmaya sokulduğunda, bir plazmit kopyalanacak ve incelenen DNA fragmanının çok sayıda kopyası oluşturulacaktır. Bu videoda, plazmit saflaştırmasının nasıl...

Jel saflaştırma, elektroforetik ayırmadan sonra DNA parçalarını geri kazanmak için kullanılır. Bir agaroz jelden DNA geri kazanımı üç temel adım içerir: bir silika kolonundan bağlanma, yıkama ve ayrıştırma. DNA'nın bir tuz köprüsü yoluyla yüksek tuz varlığında silikaya bağlandığına inanılmaktadır. Bağlanmayı takiben, DNA safsızlıklardan yıkanır ve bu etkileşimi bozan düşük tuz koşulları altında ayrıştırılır. Bu video, jelden bir bandı kesmek, jel çözündürme, bir silika kolonuna bağlanma...

Western Blotting, elektroforetik olarak ayrılmış numunelerde spesifik proteinlerin varlığını tanımlamak için kullanılır. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi veya SDS-PAGE olarak bilinen bir teknikle ayrıldıktan sonra, proteinleri bir poliakrilamid jelden proteinleri kendi konumlarında yakalayan bir zar parçasına taşımak için batı transferi kullanılır. Daha sonra, zarlar, immunboblotting adı verilen bir işlemle antikorlarla incelenir. İmmünoblotlama, tek bir proteini...

Transfeksiyon, DNA ve çift sarmallı RNA gibi genetik materyalin memeli hücrelerine yerleştirilmesi işlemidir. DNA'nın bir hücreye sokulması, hücrelerin kendi makinelerini kullanarak proteinlerin ekspresyonunu veya üretimini sağlarken, RNA'nın bir hücreye sokulması, translasyonu durdurarak belirli bir proteinin üretimini aşağı regüle etmek için kullanılır. Transfekte edilmiş RNA'nın etki alanı sitoplazma iken, etkili transfeksiyon için DNA'nın çekirdeğe taşınması gerekir. Orada, DNA kısa bir...

Moleküler biyolojide ligasyon, bir fosfodiester bağı oluşumu yoluyla iki DNA parçasının birleştirilmesini ifade eder. Ligaz olarak bilinen bir enzim, ligasyon reaksiyonunu katalize eder. Hücrede ligazlar, DNA replikasyonu sırasında meydana gelen tek ve çift iplikçik kopmalarını onarır. Laboratuvarda, moleküler klonlama sırasında DNA ligaz, eklerin DNA parçalarını, konakçı organizmalarda hedef parçaları çoğaltacak vektörler - taşıyıcı DNA molekülleri ile birleştirmek için kullanılır. Bu...

Restriksiyon enzimleri veya endonükleazlar, DNA'yı belirli bir dizide tanır ve keser. Bu enzimler, bakterileri enfekte eden virüsler olan bakteriyofajlara karşı bir savunma olarak bakterilerde doğal olarak bulunur. Bakteriyel kısıtlama enzimleri, istilacı bakteriyofaj DNA'sını keserken, metil gruplarının eklenmesi nedeniyle bakteri genomik DNA'sını zarar görmeden bırakır. Bu video, aşağıdakiler de dahil olmak üzere kısıtlama enzimlerinin temel ilkelerini açıklamaktadır: kısıtlama...

Moleküler klonlama, rekombinant DNA'yı, konakçı organizmalarda rekombinant DNA parçalarını çoğaltacak DNA moleküllerinin bir taşıyıcısı olan bir vektöre eklemek için kullanılan bir dizi yöntemdir. Bir gen olabilen DNA parçası, prokaryotik veya ökaryotik bir örnekten izole edilebilir. İlgilenilen parçanın veya ekin izolasyonunu takiben, hem vektör hem de kesici uç, kısıtlama enzimleri ile kesilmeli ve saflaştırılmalıdır. Saflaştırılmış parçalar, ligasyon adı verilen bir teknikle birleştirilir.