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Organic Chemistry II

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Síntese de Fase Sólida

Overview

Fonte: Vy M. Dong e Diane Le, Departamento de Química da Universidade da Califórnia, Irvine, CA

A síntese em fase sólida de Merrifield é uma invenção vencedora do Prêmio Nobel onde uma molécula reagente é ligada a um suporte sólido e sofre sucessivas reações químicas para formar um composto desejado. Quando as moléculas estão ligadas a um suporte sólido, reagentes e subprodutos em excesso podem ser removidos lavando as impurezas, enquanto o composto alvo permanece ligado à resina. Especificamente, mostraremos um exemplo de síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS) para demonstrar esse conceito.

Principles

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A síntese em fase sólida é um método usado para simplificar a síntese das moléculas. É frequentemente usado em química combinatória (técnica usada para preparar um grande número de moléculas em um curto período de tempo), para gerar bibliotecas de compostos devido à facilidade de purificação, e síntese química global. A síntese em fase sólida normalmente envolve o uso de uma resina; um material não solúvel, à base de polímero, que é pré-funcionalizado para que o bloco de construção inicial possa se ligar facilmente. Os blocos de construção são geralmente protegidos uma vez que são adicionados à resina, e eles podem ser facilmente desprotegidos e tratados com o próximo bloco de construção desejado na solução(Figura 1). Uma vez que a molécula desejada tenha sido sintetizada, ela pode ser facilmente cortada da resina.

Por ser robusta, a síntese em fase sólida tem sido usada para sintetizar ácidos nucleicos, oligossacarídeos e, mais comumente, peptídeos. Descoberto e relatado por Robert Bruce Merrifield em 1963, o SPPS tornou-se o método mais utilizado para gerar bibliotecas de peptídeos. Merrifield ganhou o Prêmio Nobel de 1984 pela invenção do SPPS. SpPS pode facilmente tirar proveito de grupos de proteção de Fmoc (base sensível) ou Boc (sensível a ácido)Nnos aminoácidos para construir bibliotecas de peptídeos em um curto espaço de tempo. HBTU (agente de acoplamento) e i-Pr2EtN (base) ativam o C-terminus do aminoácido para acoplamento com outro aminoácido. Grupos de proteção de afoc podem ser removidos por 4-metilpiperidina, enquanto grupos de proteção de Boc podem ser removidos por ácidos fortes, como o ácido trifluoroacético. Neste experimento, demonstraremos SPPS através da síntese de um dipeptídeo. Usaremos o teste Kaiser, um método qualitativo para testar a presença de aminas primárias, para monitorar o progresso da reação.

Figure 1
Figura 1. Conceito por trás da síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS).

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Procedure

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1. Carregando a resina

  1. Para um vaso de síntese de peptídeos de 100mL, adicione resina de cloreto de clororitil (CTC) de 2ml (1,1 mmol/g, 0,360 g, 0,400 mmol). Adicione 20 mL DMF e deixe-os inchar por 30 minutos sob N2.
  2. Escorra as contas sob vácuo e adicione 10 mL DMF.
  3. Adicione 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) e 2,5 mL i-Pr2EtN, e misture sob N2 por 15 min.
  4. Escorra o solvente sob vácuo e repita o carregamento com Fmoc-Ala-OH por 15 min.
  5. Escorra o solvente sob vácuo e lave as contas com 10 mL DMFunder N2, e escorra sob vácuo 3x.

2. Desproteção do Grupo Fmoc

  1. Adicione 10 mL 20% 4-metilpiperidina em DMF e mexa as contas sob N2 por 15 minutos.
  2. Escorra o solvente sob vácuo e repita a desproteção.
  3. Lave as contas com 10 mL DMF sob n2 e escorra sob vácuo 3x.

3. Realizando o Teste Kaiser

  1. Realize o teste Kaiser adicionando 1-2 gotas de solução A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL pyridine), solução B (1 g ninhydrin, 20 mL n-butanol) e solução C (20 g de fenol, 10 mL n-butanol) cada um em dois tubos de teste. Um tubo de ensaio será o controle, enquanto o outro monitorará a reação.
  2. Adicione algumas contas da resina do vaso de reação ao tubo de ensaio de reação e aqueça os dois tubos de ensaio a 110 °C.
  3. Se a desproteção estiver completa, o conteúdo do tubo de ensaio ficará uma cor azul/roxo escuro. Se a desproteção estiver incompleta ou falhar, a solução permanecerá amarela. Compare o tubo de ensaio de reação com o tubo de teste de controle.

4. Acoplamento dos próximos blocos de construção

  1. Escorra o solvente sob vácuo.
  2. Lave as contas com 10 mL N-metil-2-pyrrolidona sob n2 e escorra o solvente sob vácuo.
  3. Para iniciar o próximo acoplamento, adicione 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), HBTU de 610 mg (1,6 mmol) e 2,5 mLi-Pr2EtN, e deixe a resina borbulhar sob n2 por 30 minutos.
  4. Escorra o solvente sob vácuo.
  5. Lave as contas com 10 mL DMF sob n2 e escorra sob vácuo 3x.
  6. Realize o teste Kaiser (ver etapas 3.1-3.3) para procurar a conclusão do acoplamento. As contas e a solução no tubo de ensaio devem ser amarelas.

5. Cleaving o Peptídeo Fora da Resina

  1. Adoça o restante do grupo Fmoc utilizando as etapas 2.1-2.3.
  2. Depois que o solvente for drenado sob vácuo, adicione 40 mL de solução de decote (95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% TIPS) à resina e bolha sob N2 por 3h.
  3. Coloque um novo frasco receptor no sintetizador de peptídeo e escorra a soluçãoTFA contendo o peptídeo desejado sob vácuo no novo frasco.

6. Precipitação e eu solação do Peptídeo

  1. Separe a solução TFA em 4 frascos cônicos e adicione 25 mL de éter frio (−20 °C) a cada frasco para precipitar o peptídeo.
  2. Centrifugar os frascos (3.000 rpm, 0-4 °C) por 20 min. Decante a solução tfa restante e éter dos frascos cônicos e concentre o peptídeo precipitado para pagar o dipeptídeo desejado como um sólido branco.

A síntese de fase sólida é um método no qual o produto é sintetizado enquanto vinculado a um material insolúvel.

A síntese de fase sólida é frequentemente usada para produzir oligômeros biológicos e polímeros como peptídeos, ácidos nucleicos e oligossacarídeos. Essas moléculas são compostas de cadeias de subunidades moleculares menores, chamadas monômeros. Sintetizar um oligômero ou polímero dá muitos passos, pois os monômeros devem ser adicionados na ordem correta.

Um problema com as sintetizações em várias etapas é que a purificação e o isolamento dos produtos estáveis de cada etapa, chamados de produtos intermediários,diminui o rendimento geral. Em síntese de fase sólida, o produto intermediário permanece vinculado ao suporte sólido ao longo da síntese. Isso permite que reagentes, solventes e subprodutos da fase de solução sejam lavados, eliminando a necessidade de purificar e isolar cada produto intermediário entre as etapas.

Este vídeo ilustrará o procedimento para síntese de peptídeos de fase sólida e introduzirá algumas aplicações de síntese de fase sólida em química.

Na síntese em fase sólida, uma molécula é sintetizada em um suporte sólido em uma sequência de reações. Por exemplo, um oligômero ou polímero será sintetizado um monômero de cada vez para formar o produto final. O oligômero ou polímero em crescimento permanece fortemente ligado ao suporte sólido até que seja separado, ou cortado,do suporte com reagentes.

Cada monômero deve ter pelo menos dois locais de ligação para fazer parte da cadeia de polímeros, mas apenas um local de ligação pode estar disponível por vez para garantir que o monômero se ligue ao átomo correto. Isso é conseguido com grupos de proteção, que são grupos funcionais que não são reativos durante uma ou mais etapas da síntese. O local de ligação é restaurado, ou desprotegido,tratando a molécula com reagentes específicos para converter o grupo de proteção em um grupo funcional reativo.

Para iniciar a síntese em fase sólida, o material de partida está vinculado a uma resina especialmente projetada ou polímero insolúvel em seu único local de ligação disponível. Em seguida, o material de partida vinculado é desprotegido para permitir a ligação do segundo monômero na cadeia. Em seguida, adiciona-se uma solução do segundo monômero da cadeia, juntamente com um agente de acoplamento para facilitar a ligação entre os monômeros.

Uma vez que o segundo monômero se liga ao material inicial, o produto intermediário dimeric resultante é desprotegido. Este processo é repetido até que o oligômero ou polímero alvo se forme. O produto é cortado do suporte sólido para a solução, a partir do qual pode ser purificado, isolado e analisado.

A síntese de fase sólida é frequentemente usada para a síntese de peptídeos, que são cadeias de aminoácidos. Os aminoácidos têm um grupo de amina, um grupo carboxyl, e um substituto, ou "cadeia lateral". A amina é inicialmente protegida. Uma vez desprotegida, a amina forma uma ligação de peptídeo com o grupo carboxíl do próximo aminoácido.

Agora que você entende os princípios da síntese de fase sólida, vamos passar por um procedimento para síntese de peptídeos de fase sólida, no qual demonstraremos a adição dos dois primeiros aminoácidos.

Para iniciar o procedimento, conecte um frasco receptor para resíduos a um vaso de síntese manual de peptídeos de 100 mL. Em seguida, coloque 0,360 g de resina de cloreto de 2 clorororizais no vaso. Conecte uma linha de gás nitrogênio ao sidearm do vaso e uma linha de vácuo ao adaptador de mangueira serrilhada.

Adicione 20 mL de dimetilformamida à resina e deixe as contas de resina incharem por 30 minutos sob um fluxo de gás nitrogênio. Em seguida, aplique vácuo para drenar o solvente.

Adicione 10 mL de DMF, 1,6 mmol de aminoácido protegido por Afoc e 2,5 mL de N,N-diisopropylethylamina ao vaso. Bolha sob o gás nitrogênio, que mistura a solução, por 15 minutos para carregar o aminoácido protegido na resina.

Remova o solvente sob vácuo e realize um segundo carregamento. Depois de remover o solvente, agitar as contas de resina carregada três vezes em porções de 10 mL de DMF, drenando cada lavagem no frasco receptor.

Em seguida, adicione às contas carregadas 10 mL de uma solução de 20% de 4-metilpiperidina em DMF. Misture a mistura por 15 minutos para remover o grupo Fmoc.

Escorra o solvente e repita o procedimento de desproteção. Lave e escorra a resina carregada três vezes, como antes. Armazene as contas sob solvente até que estejam prontas para o próximo passo.

Para verificar se o composto carregado estava completamente desprotegido, primeiro lugar 1 a 2 gotas de cada solução de teste Kaiser em dois tubos de ensaio.

Coloque algumas contas carregadas em um tubo de ensaio e aqueça ambos os tubos a 110 graus em um banho de óleo. A desproteção é completa se a mistura de resina ficar azul escuro para roxo, indicando a presença de grupos de amina na mistura.

Para começar o passo de acoplamento, primeiro lave as contas com 10 mL de NMP sob um fluxo de gás N2.

Em seguida, adicione 10 mL de NMP, 1,6 mmol do aminoácido protegido por Afoc, 1,6 mmol do agente de acoplamento HBTU e 2,5 mL de DIPEA à resina carregada.

Bolha N2 gás através da mistura de resina por 30 minutos, e, em seguida, drenar o solvente. Lave e escorra as contas com porções de 10 mL de DMF três vezes, como antes.

Repita o teste kaiser. O acoplamento ocorreu com sucesso se as contas e a solução ficarem amarelas, indicando que não há grupos de amina presentes.

Em seguida, aperte o novo grupo Fmoc com 20% de 4-metilpiperidina em DMF e lave as contas com porções de 10 mL de DMF. Repita o acoplamento e a desproteção de cada aminoácido restante no peptídeo alvo.

Depois que o último aminoácido tiver sido desprotegido e as contas de resina terem sido lavadas, adicione 40 mL de solução de decote peptídeo para separar o produto peptídeo da resina.

Bolha de gás nitrogênio através da mistura de resina por 3h, e, em seguida, substituir o frasco receptor. Transfira a solução da mistura de resina para o novo frasco receptor sob vácuo.

Para gerar o produto final, remova o solvente com um evaporador rotativo.

A síntese de fase sólida é amplamente utilizada em biologia e química. Vamos ver alguns exemplos.

A síntese em fase sólida abriu muitas novas vias sintéticas para oligossacarídeos, que são cadeias curtas de monômeros de açúcar simples com importantes papéis biológicos, como o armazenamento de energia. Ao contrário das ligações de peptídeos, cada ligação entre açúcares contém um estereótipo. Para sintetizar um oligosacarídeo, não só os monômeros devem estar na ordem correta, mas os laços também devem ter a estereoquímica correta. Técnicas de síntese em fase sólida foram desenvolvidas para acoplar cada monômero por um processo altamente estereoselétrico, que hoje é suficientemente refinado para ser automatizado.

A síntese em fase sólida é uma abordagem comum da química combinatória,que é a prática de sintetizar muitas variantes de um composto em um único processo sintético. A resina carregada pode ser facilmente dividida em porções para reagir com diferentes monômeros ou moléculas. Após cada reação, as porções são lavadas e recombinadas. Isso se repete até que o número desejado de produtos tenha sido gerado. Esta técnica é particularmente útil em pesquisas farmacêuticas, pois pode ser usada para gerar novos compostos ou para avaliar a reatividade de um composto com uma ampla gama de moléculas.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à síntese de fase sólida. Agora você deve entender os princípios subjacentes da síntese de fase sólida, o procedimento para a síntese de peptídeos de fase sólida, e alguns exemplos de como a síntese de fase sólida é usada na química orgânica. Obrigado por assistir!

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Results

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Resultados representativos para a síntese de peptídeos de fase sólida para o Procedimento 3.

Etapa do procedimento Cor da solução
3.1 Controle - Amarelo claro e claro
Reação – Amarelo claro e claro
3.2 Controle - Amarelo claro e claro
Reação – Azul escuro
3.3 Solução azul escuro, azul das contas – desproteção completa ou falha no acoplamento
Incolor, contas amarelas – desproteção falha ou completa
Solução incolor, contas vermelhas – acoplamento incompleto ou desproteção incompleta

Mesa 1. Resultados representativos para Procedure 3.

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Applications and Summary

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Neste experimento, demonstramos um exemplo de síntese em fase sólida via SPPS através da síntese de um dipeptídeo.

A síntese em fase sólida é amplamente utilizada na química combinatória para construir bibliotecas de compostos para triagem rápida. Tem sido comumente usado para sintetizar peptídeos, oligossacarídeos e ácidos nucleicos. Além disso, esse conceito foi implementado na síntese química. Por ser heterogêneo, esses reagentes de suporte sólido podem muitas vezes ser reciclados e reutilizados em reações subsequentes.

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Transcript

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