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Transducción de fagos: Un método para transferir la resistencia a la ampicilina del donante al receptor E. coli

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Las bacterias pueden adaptarse rápidamente a un entorno que cambia rápidamente mediante el intercambio de material genético y una manera de hacerlo es a través de la transducción, el intercambio de material genético mediado por virus bacterianos. Un bacteriófago, a menudo abreviado como fago, es un tipo de virus que infecta las bacterias al adherirse primero a la superficie del huésped y luego inyectar su ADN en la célula bacteriana. A continuación, degrada el propio ADN de la célula huésped y replica su genoma viral, mientras secuestra la maquinaria de la célula para sintetizar muchas copias de sus proteínas. Estas proteínas de fago se autoensamblan y empaquetan los genomas del fago para formar progenie múltiple. Sin embargo, debido a la baja fidelidad del mecanismo de empaquetado de ADN, ocasionalmente, el fago empaqueta fragmentos de ADN bacteriano en la cápside del fago. Después de inducir la lisis del huésped, la progenie del fago se libera y, una vez que un fago infecta otra célula huésped, transfiere el fragmento de ADN de su huésped anterior. Esto puede recombinarse y incorporarse permanentemente al cromosoma del nuevo huésped, mediando así la transferencia de genes entre las dos bacterias.

Para llevar a cabo la transducción de fagos en el laboratorio se requiere una cepa de donante que contenga un gen de interés, una cepa receptora que carece de ella, un fago que pueda infectar ambas cepas y un método para seleccionar las bacterias transducidas. En la mayoría de los casos, este será un medio de crecimiento sólido selectivo que apoya el crecimiento de bacterias transducidas pero inhibe el crecimiento de las no transducidas. Para empezar, la cepa del donante que contiene el gen del interés se cultiva en un medio de crecimiento líquido. Cuando todas las bacterias se dividen activamente en la fase de registro de su crecimiento, el cultivo se inocula con el fago objetivo. Después de tres a cuatro horas de incubación, cuando casi todas las bacterias han liado y liberado las partículas de fago, el lisato de fago donante se inocula en un cultivo recién cultivado de la cepa bacteriana receptora. Después de una breve incubación de una hora, el cultivo ahora debe contener una mezcla de células bacterianas transducidas y no transducidas y esto se examinan para las células transducidas mediante la propagación de una fracción de la suspensión en un medio de crecimiento sólido selectivo apropiado. Tras una mayor incubación, las células transducidas deben crecer y multiplicarse para producir colonias visibles. Estas colonias se pueden seleccionar para un análisis posterior utilizando una variedad de métodos para confirmar aún más la transducción exitosa, como PCR de colonias, secuenciación de ADN o PCR cuantitativa.

Antes de iniciar el procedimiento, ponte cualquier equipo de protección personal adecuado, incluyendo una capa de laboratorio y guantes. A continuación, esterilizar el espacio de trabajo con 70% de etanol y limpiar la superficie.

Después de esto, prepare tres alícuotas de un mililitro de solución de sal de LB. Ahora, preparar un cultivo de cepa de donante mediante la adición de 100 microlitros de E. coli a un vial cónico de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de medio de crecimiento LB con 500 microgramos de ampicilina. Luego, cultivar el cultivo durante la noche a 37 grados centígrados con aireación y temblor a 220 rpm. Al día siguiente, limpie la parte superior del banco con 70% de etanol antes de retirar el cultivo de la incubadora de temblores. A continuación, diluir el cultivo nocturno de uno a 100 mediante la adición de 10 microlitros de cepa de donante a 990 microlitros de LB fresco complementado con solución de sal.

Permita que la dilución bacteriana crezca a 37 grados centígrados durante dos horas con aireación y agitación a 220 rpm. Una vez que las células han alcanzado la fase de registro temprano, eliminar el cultivo de la incubadora, añadir 40 microlitros de fago P1 al cultivo e incubar de nuevo. Continúe monitoreando las células durante una o tres horas hasta que el cultivo se haya lisado. A continuación, añadir 50 a 100 microlitros de cloroformo al lisado y mezclar por vórtice. Luego, centrifugar el liso para eliminar los escombros y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Añadir unas gotas de cloroformo al sobrenadante y almacenarlo a cuatro grados Celsius por no más de un día.

Para comenzar el procedimiento de transducción, obtenga un cultivo de un mililitro de cepa receptora. A continuación, transferir 100 microlitros de lisato de fago donante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e incubarlo a 37 grados centígrados con la tapa abierta durante 30 minutos para permitir que cualquier cloroformo restante se evapore. Mientras que el fago donante lisato incuba, pellet las células de cepa receptoras a través de una centrifugación suave. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 300 microlitros de LB fresco que contenga 100 milimolares de sulfato de magnesio y cinco milimolares de cloruro de calcio.

A continuación, configure la reacción de transducción combinando 100 microlitros de la cepa receptora y 100 microlitros del lisato de fago donante en un tubo de microcentrífuga. A continuación, configurar el control negativo mediante la combinación de 100 microlitros de la cepa receptora y 100 microlitros de la LB con sulfato de magnesio y cloruro de calcio. Después de la incubación, agregue 200 microlitros de un citrato de sodio molar y un mililitro de LB a ambos tubos, y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Luego, después de que los tubos hayan sido incubados durante una hora, pelete suavemente las células a través de la centrifugación.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda las células peletadas en 100 microlitros de LB con citrato de sodio de 100 milimolares. Vortex las soluciones y pipetear toda la muestra transducida en una placa de agar LB con 1X ampicilina. Por último, pipetee todo el volumen de la mezcla de células de control negativas en una placa de agar LB sin ampicilina. Después de incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados, utilice una punta de pipeta estéril para recoger de tres a cuatro colonias de la placa de transducción y fíjelas en una nueva placa de agar LB que contenga 1X ampicilina y 100 microlitros de un citrato de sodio molar. Repita este método de chapado para el control negativo en otra placa de agar LB que contenga sólo 100 microlitros de un citrato de sodio molar. Luego, incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche para permitir que las colonias libres de fago crezcan.

Al día siguiente, limpie la parte superior del banco con 70% de etanol antes de retirar las placas de la incubadora. Usando una punta de pipeta estéril, escoja tres colonias de la placa de transducción y agréguelas cada una a un tubo separado que contenga cinco mililitros de medios LB. A continuación, seleccione tres colonias de la placa de control negativa y agréguelas a otro tubo que contenga cinco mililitros de medios LB. Cultivar los cultivos durante la noche a 37 grados centígrados con aireación y agitación a 220 rpm. Después de esterilizar la mesa de trabajo como se demostró anteriormente, utilice un kit de minipresión de ADN para aislar el ADN de 4,5 mililitros de cada cultivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, eluye el ADN con 35 microlitros de agua libre de nucleasas y mida la concentración resultante por espectrofotómetro de laboratorio. Finalmente, preparar las existencias de glicerol añadiendo los 0,5 mililitros restantes de ambas soluciones bacterianas a 0,5 mililitros de 100% de glicerol.

Para confirmar la transducción, primero prepare dos mezclas maestras qPCR para 24 reacciones qPCR. Para la primera mezcla maestra, agregue 150 microlitros de mezcla tampón qPCR a un tubo de microcentrífuga y 12 microlitros cada uno de una imprimación delantera y inversa diseñada para amplificar el gen de resistencia a la ampicilina. A continuación, prepare una segunda mezcla maestra qPCR añadiendo 150 microlitros de mezcla maestra qPCR a un tubo de microcentrífuga y luego agregando 12 microlitros cada uno de una imprimación hacia adelante y una imprimación inversa diseñada para amplificar un gen de limpieza.

Para cada reacción qPCR, combine 100 microgramos de ADN experimental de cada reacción con 14,5 microlitros de mezcla maestra qPCR. Ahora, prepare las reacciones restantes como se demostró anteriormente. Transfiera las reacciones a un termociclador precalentado a 94 grados Celsius y luego inicie el programa. Por último, utilice los valores de cuantificación del ciclo, o Cq, generados por qPCR para calcular la eficiencia de transducción normalizada del gen de resistencia a la ampicilina.

Los valores de cuantificación de ciclo, o Cq, para los genes de interés se tabularon para cada uno de los controles negativos y muestras transducidas. Los valores Bajos de Cq, normalmente por debajo de 29 ciclos, como las muestras transducidas en este ejemplo, indican cantidades altas de la secuencia de destino.

Un gen de limpieza, también tabulado aquí, se utiliza como un control de carga para normalizar la cantidad de ADN en cada reacción y como un control positivo para asegurar que el qPCR está funcionando. Siempre que se carguen las mismas cantidades del gen de limpieza, se encuentra a una velocidad relativamente igual en cada muestra.

A continuación, para calcular el valor delta Cq para cada muestra, reste el valor Cq del gen de limpieza para cada muestra del valor Cq de su gen de destino correspondiente. Por ejemplo, el delta Cq del primer control negativo es 13.54. A continuación, utilice este valor para calcular la eficiencia de transducción normalizada de cada muestra utilizando la fórmula que se muestra aquí. Por último, se puede calcular la eficiencia media de transducción normalizada para cada grupo de muestra.

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