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Freeze-Cracking of Nematodes

 
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Freeze-Cracking of Nematodes: A Method to Expose Interior Worm Tissues for Staining

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- Transférer les C. elegans lavés dans du liquide sur une lame de verre préalablement recouverte de polylysine, un composé qui aidera les cuticules de ver à coller à la surface du verre. Appuyez doucement sur une autre glissière de verre directement vers le bas avec un bord surplombant la glissière inférieure. Pour immobiliser les vers sans dommage, compressez les animaux en évitant tout mouvement latéral. Ensuite, placez les glissières de verre avec des vers pris en sandwich sur un bloc métallique à l’intérieur d’un récipient de laboratoire isolé rempli d’un agent de congélation, comme de l’azote liquide ou de la glace sèche.

Le métal est un conducteur de température efficace assurant que la surface du bloc est suffisamment froide pour geler rapidement les cuticules du ver sur les deux surfaces vitrées. Une fois congelés, séparez rapidement les glissières de verre pour séparer ou casser les cuticules de ver. Procéder à la fixation et à la coloration des tissus comme perturbation de la cuticule à faible perméabilité permet aux fixatifs chimiques et aux anticorps de coloration d’accéder aux tissus intérieurs du ver. Dans le protocole suivant, nous verrons une démonstration détaillée de la technique de fissuration du gel et de la fixation des tissus.

- Tout d’abord, préparer une diapositive pour fixer les vers. Pipette 30 microlitres de poly-L-lysine sur une diapositive, unnd puis, mettre une deuxième diapositive sur l’autre et lesfrotter ensemble pour étendre la solution uniformément sur les deux. Maintenant, peler les deux diapositives et les laisser sécher à l’air pendant 30 minutes. 

Ensuite, placez un bloc métallique plat dans un récipient rempli d’azote liquide. Lavez les plaques avec la solution M9 et transférez environ 10 microlitres de M9 contenant les vers. Alternativement, choisissez les vers et ajoutez M9 à la lame.

Une fois que les vers sont transférés, déposez doucement un coverslip sur eux de sorte que le coverslip surplombe un bord. Puis, appuyez doucement sur le coverslip sans faire de mouvements latéraux.

Maintenant, transférez immédiatement la glissière au bloc métallique dans de l’azote liquide et laissez-la geler. Après cinq minutes, feuilletez le coverslip à l’aide du bord en surplomb. Faites-le rapidement pour obtenir la fissure appropriée de la cuticule.

Ensuite, plongez la glissade dans un bocal coplin rempli de méthanol à moins 20 degrés Celsius. Après cinq minutes, transférez la lame dans un bocal coplin rempli d’acétone pendant encore cinq minutes à la même température. Les toboggans peuvent être tachés directement ou stockés à moins 20 degrés Celsius.

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