Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Yıkanmış C. elegans'ı sıvı olarak daha önce poli lizinle kaplanmış bir cam kaydırağa aktarın, solucan kütiküllerinin cam yüzeye yapışmasını sağlayacak bir bileşik. Başka bir cam kaydırağı, alt kaydırağın üzerine sarkan bir kenarla hafifçe bastırın. Solucanları hasar görmeden hareketsiz hale getirmek için, herhangi bir yanal hareketten kaçınarak hayvanları sıkıştırın.
Metal, blok yüzeyinin solucanın maniküllerini her iki cam yüzeye de hızlı bir şekilde donduracak kadar soğuk olmasını sağlayan etkili bir sıcaklık iletkenidir. Dondurulduktan sonra, solucan manikürlerini ayırmak veya çatlamak için cam slaytları hızla ayırın. Düşük geçirgenlik piktinin bozulması kimyasal fiksatiflerin ve boyama antikorlarının iç solucan dokularına erişmesine izin verdiğinden doku fiksasyonu ve lekeleme ile devam edin. Aşağıdaki protokolde, donma-çatlama tekniğinin ve doku fiksasyonunun ayrıntılı bir gösterimini göreceğiz.
- İlk olarak, solucanları sabitlemek için bir slayt hazırlayın. Pipet 30 mikrolitre poli-L-lizin bir slayt üzerine, birnd sonra, diğerine ikinci bir slayt ayarlayın ve çözeltiyi her ikisine de eşit bir şekilde yaymak için birlikte ovalayın. Şimdi, iki slaydı soyun ve 30 dakika boyunca kurumaya bırakın.
Daha sonra, sıvı nitrojenle dolu bir kaba düz bir metal blok yerleştirin. Plakaları M9 çözeltisi ile yıkayın ve solucanları içeren yaklaşık 10 mikrolitre M9 aktarın. Alternatif olarak, solucanları seçin ve Slayda M9 ekleyin.
Solucanlar transfer edildikten sonra, örtünün bir kenarı aşarak geçmesi için üzerlerine hafifçe bir kapak zarı bırakın.
Şimdi, slaytı hemen sıvı nitrojendeki metal bloğa aktarın ve donmasına izin verin. Beş dakika sonra, sarkan kenarı kullanarak kapak kapağını kaydırın.
Daha sonra, slaydı eksi 20 santigrat derecede metanoldolu bir cam Coplin kavanozuna daldırin. Beş dakika sonra, kaydırağı aynı sıcaklıkta beş dakika daha asetondolu bir cam Coplin kavanozuna aktarın.
