Name: Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Öğrenin kemirgen beyin dilimlerinden vibrodissosiasyon ile canlı nöron izolasyonunu ve presinaptik butonların görüntülenmesini. Bu yöntem sinaptik fizyoloji ve farmakoloji çalışmalarında gelişmiş voltaj kelepçesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Dr kabul etmek istiyorum. Ilk sırasında yardım için Ping Haziran Zhu ve Susumu Koyama tekniğin kurmak ve yardım için yazılmış bir el yazması biçimlendirme Dr Veronica Alvarez. Bu çalışmada NIAAA İntramural Klinik ve Biyomedikal Araştırma Bölümü tarafından finanse edildi.

1. Hazırlanması Alev Sızdırmaz Cam Mikropipet <ol><li> Mikroelektrot cam kullanarak, Flaming-Brown ya da eşdeğer bir mikropipet çektirmesi (ucu çapı ~ 2 mm) standart bir yama klemp mikropipet çekin. Yeri mikropipet ~ 2 saniye boyunca erimiş top kıvamına gelinceye kadar 200-300 mikron çapında bir Bunsen beki alev ucu. </li><li> Piezoelektrik bimorph, röle veya eşdeğer etkili cihaz kullanarak hızlı bir şekilde (seyahat mesafesi 100-200 mikron) yan-yan titreşilecek bir mikromanipülatör tutucu üzerine yerleştirin alev sızdırmaz yama pipet. </li></ol> 2. P1-P21 Sıçanlar ya da Fare Beyin Dilimleri hazırlanması <ol><li> 124 NaCl, 4.5 KCl, 1.2 NaH 2 NaHCO 3 PO 4, 26 ve 10 D-glukoz: Aşağıdaki kompozisyonu (mM) ile yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlayın. ~ 15 dakika süreyle% 95 oksijen /% 5 CO 2 gaz Bubble çözümü, daha sonra 2 mM CaCl 2 ve 1 mM MgCl 2 ekleyin. </li><li> Kesme beyin kesitleri: <ol><li> Halotan ve izofluran ile hayvan anestezisi. Hayvan başını kesmek - beyin kaldırmak istenilen açıda (koronal parasagital, enine, vb) blok beyin ilgi bölgesini de dahil etmek. </li><li> Yapıştırmayın aCSF batmış bir titreşimli beyin dilimleyiciyi aşamasında bloke beyin 250-400 mikron kalınlığında bölümünde beyin - aCSF dilimler tüm yüzeylerde sıvı / gaz maruziyeti sağlar file "preinkübasyon" odasına carbogen ile kabarmış dilimleri, bu ortamda en az bir saat gelmesini sağlayınız. </li></ol></li></ol> 3. Vibrodissociation <ol><li> Ve NaOH 150 NaCl, 5 KCl, 10 Hepes, 1 MgCl 2, 2.5 CaCl 2, 10, pH 7.4 'e ayarlanmış olan D-glukoz: Aşağıdaki kompozisyonu (mM) Hepes-tamponlu salin solüsyonu ile 35 mm çap kültür kaplarına doldurun ozmolarite ~ 300 mOsm sakaroz kullanılarak ayarlanabilir. Kültür yemekleri süspansiyon yemekleri, standart hücre kültürü yemekleri, cam lamel ekler ile kültür kaplarına veya yemekler çanak alt güçlü hücre bağlılık için ihtiyaç bağlı olarak, örneğin, poli-L-lizin ile kaplı olabilir. </li><li> Dilim kültür çanak yerleştirin ve 250 x. bir diseksiyon Stereoskop ile görselleştirmek Dilim dilim üst yüzeyine yerleştirilen bir ağırlık olarak hareket etmek bükük bir platin tel (0,5 mm çap) kullanarak alt tutun. </li><li> Istenen beyin bölgesi dilim yüzeyinde alev sızdırmaz mikropipet ucu yerleştirin. Gezi mesafe ~ 100 mm, 10-30 Hz'de yanal ucu titreşmeye mikromanipülatör etkinleştirin. Mikromanipülatör kullanarak, ~ 30 saniye içinde tüm dilim geçtiği gibi dilim doku derinliklerine ucu hareket ettirin. Verilen bir beyin bölgesi elde izole nöronların sayısını en üst düzeye çıkarmak için gerekli olan bu adımı yineleyin. </li><li> Dilim ucu Kaldır - dilim forseps ile pick up ve hala bir çözüm ise yavaşça sallayın sonra tamamen dilim çıkarın ve atın. </li><li> Ayrışmış hücreleri en az 10 dakika boyunca çanak alt uymak ve yerleşmek için izin verin. </li></ol> 4. Elektrofizyolojik Kayıt <ol><li> Ters bir mikroskop sahnede nöron içeren çanak yerleştirin ve 10 x 63 x objektif ile görselleştirmek. Düzgün bir patent membran, hiçbir blebbing ve algılanabilir ama büyük boyutlu değil çekirdeği ile nöronlar için bakın. Faz kontrast optik kullanılması durumunda da mavi değil, sarımsı-belirti ile faz-parlak nöronlar için. Istenen tuzlar, besinler, reseptör antagonistleri içeren ekstrasellüler çözümü ile Superfuse hücreleri, vb (standart yukarıda belirtilen Hepes-tamponlu salin (bkz. bölüm 3.1)), genellikle 5 mcM 2,3-dioxo-6-nitro-1 ile desteklenmiş 2,3,4-tetrahidrobenzo hızlı GABA izolasyonu sağlar inotropik glutamat reseptörleri bloke [f] quinoxaline-7-sülfonamid disodyum (NBQX) ve 25-100 mcM D-2-amino-5-phosphonopentanoic asit (AP5) reseptör-aracılı IPSCs 1,2. </li><li> Flaming-Brown veya eşdeğer çektirmenin kullanarak standart bir yama mikropipet çekin. Pipet ucu direnci M 2-4 (hedef hücre boyutuna bağlı olarak) bir Cl ile dolu olmalıdır - tabanlı bir çözüm. </li><li> Standart elektrofizyolojik teknikler kullanılarak görüntülenmiştir nöron bir tam hücreli kayıt oluşturulması. </li><li> Bir boşluk ücretsiz veri toplama protokolü kullanılarak spontan postsinaptik akımlar (sPSCs) kaydedin. 0,2-1 mcM tetrodotoxin ve / veya düşük Ca 2 + uygulayın ekstrasellüler çözüm içeren minyatür postsinaptik akımlar (mPSCs) kayıt için. </li><li> Çözümler ve farmakolojik ajanları, hücrelere doğrudan uygulanabilir. Biz bir step motor tahrikli mikromanipülatör üzerine monte edilmiş boru yanal hareket içeren bir çözüm değişimi ile kare uçlu erimiş cam tüpler yerel superfusion kullanın. Bu alloekstrasellüler moleküler içeriği hızlı değişimler, reseptör agonistleri uygulaması, vb elde etmek için 100'ün üzerinde ms 10s çözüm alışverişi için </li><li> Akaike ve arkadaşları tek presinaptik BOUTONS 3,4 uyarmak için teknikler geliştirdik. Mikropipet görüntülenmiştir bouton yakın yerleştirilir ve stimülasyon (5-10 uA olumsuz uyaran akımları, 0.1-0.2 ms süresi) verilir. Üniter IPSCs kaydedilir ve presinaptik ve postsinaptik fonksiyon değişiklikleri incelemek için bu tür hataları yöntemi gibi yöntemler kullanılabilir. </li></ol> 5. Görüntüleme Presinaptik Terminalleri <ol><li> Postsinaptik nöron yama pipet ile çeşitli boyalar ile dolu olabilir. Nöronlar da seçili hücre popülasyonlarında yeşil floresan proteininin (GFP) gibi floresan proteinleri (FP) ifade farelerden alınan yapılabilir. </li><li> Belirli interneuron popülasyonlarda Çerçeve ifade farelerde yapılan vibrodissociated nöronların presinaptik terminaller üzerinde görselleştirilebilir olabilir. Örneğin, glutamat dekarboksilaz 65 (GAD65) hipokampal sepet hücreleri ve diğer internöronlar organizatörü gösterisi yeşil somata ve süreçler tarafından tahrik GFP ifade fareler. Hipokampal CA1 bölgeden Vibrodissociated piramidal nöronlar somata ve proksimal dendritler (Şekil 1A) apposed GFP pozitif akson terminalleri var. Ifade synaptopHlourin (pH hassas GFP mutant sinaptik vezikül ilişkili VAMP2 protein için erimiş) pH duyarlı floresans (Şekil 1B), FP-pozitif bağlı BOUTONS Thy1 promotör kontrolü altında olduğunu fareler vibrodissociated piramidal nöronlar. </li><li> Presinaptik BOUTONS AM-esterleşmiş bileşikler 5 kullanılarak kalsiyum göstergesi boyalar ve diğer floresan moleküller yüklü olabilir. Şekil 2 kalsiyum göstergesi boya Fluo4-AM kullanarak yükleme bir örnek gösterir. İlk önce, 1-2 mcM esterleşmiş boya, 10 dakika süreyle 37 ° nöronlara uygulanır. Boya, ücretsiz, hücre geçirgenliği olmayan ve unquenched boya verimli tutunmaya esterazlar molekülün hücre içi ortamı, içine nüfuz edebilir. Bu yaklaşım, hem de pre-ve postsinaptik hücresel elemanları yükler. Yükleme sonrasında, hücrelerin Hepes-tamponlu salin solüsyonu ile yıkanır ve ek bir 10 dakika için 37 ° 'de tuttu. Cam bir pipet elektrot ile bir GΩ-mühür yapmak için, önce hücrelerin dış tampon çözelti ile 3 defa durulanır. </li><li> A tam hücreli kayıt sonra boya içermeyen hücre içi bir çözüm ile kurulur. 2-5 dakika sonra kayıt boya çoğunlukla Fluo-4 yüklü sinaptik BOUTONS görselleştirme sağlayarak, postsinaptik nöron kaldırılır. Bu teknik, Ye ve ark 5 öncülük . </li><li> Boya yüklü BOUTONS sonra, ya bir kamera tabanlı veya multiphoton mikroskop ile yüksek büyütme, yüksek sayısal açıklık amacı ile görüntülenebilir. Eşzamanlı tam hücreli kayıt ve kalsiyum görüntüleme Şekil 3'te gösterildiği gibi bir kurulum kullanarak elde edilebilir. Nöron ve Şekil 2C olarak gösterilen BOUTONS bir elektron çarparak şarj bağlı cihaz (EMCCD) kamera görüntüleri ele geçirildi. Uyarma için ışık kaynağının gücü% 12 çıkışı için ayarlanabilir bir nötr yoğunluk 1.0 filtre ve iris filtresi ile% 1.2 'ye zayıflatılmış oldu. Yeşil presinaptik BOUTONS Kalsiyum transientler gözlenen ve gerçek zamanlı olarak kaydedilen ve çevrimdışı ölçülür. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Vibrodissociated Nöronlar spontan ve Akım Enjeksiyon Uyarılmış Ateşleme Tipik bir vibrodissociated hipokampal CA1 piramidal nöron Kayıtlar Şekil 4A gösterilmiştir. Spontan overshooting aksiyon potansiyelleri sıçan bazolateral amigdala, hipokampus ve VTA 1,5 ayrı piramidal nöronlar görülebilir. Yeterli büyüklükte depolarizan akımların güçlü akım enjeksiyon yanıt olarak ılımlı mevcut seviyeleri ve non-konaklayan aksiyon potansiyelleri ile tipik gecikmeli ateşleme paterni ile overshooting aksiyon potansiyelleri ortaya akım enjeksiyon hiperpolarizan CA1 piramidal nöronlar sırasında mevcut klemp kayıtları, (tipik voltaj tepkilere neden Şekil 4B). Vibrodissociated Nöronlar spontan ve Minyatür GABAerjik inhibitör postsinaptik Akımlar CSCL tabanlı bir hücre içi çözümü ile gerilim-klemp kayıtları sırasında, spontan sinaptik akımlar (Şekil 5A) görülmektedir. Bu olaylar, düşük kalsiyum içeren çözeltisi 2,6 elimine ve en nöronal türleri tamamen GABA A reseptör antagonistleri, bicuculline veya gabazine (Şekil 5B, C) ​​olarak, GABA serbest bırakılması ve aktivasyonu aracılı sIPSCs belirten tarafından engellenir bu inotropik reseptör alt tipi. Ancak, bazolateral amigdala 2 ve ventral tegmental alan 5,7, GABA A reseptör blokajı gibi beyin bölgeleri esas nöronlarAMPA-tipi reseptörlerin glutamatergik aktivasyonu aracılığı ile kısa süreli EPSCs ortaya koymaktadır. İlginçtir, en toksin hassas voltaj kapılı sodyum kanallarının blokajı için özel konsantrasyonlarda TTX uygulama, bazı beyin bölgelerinde (Şekil 6A) 2,4,7 vibrodissociated nöronlar gözlenen sIPSCs frekans ve genlik azaltır . Bu nedenle, sodyum kanal aktivitesini sıkışmak-off sinaptik BOUTONS GABA sürümde katılır. Bu terminallerde tam gelişmiş sodyum aksiyon potansiyelleri ortaya çıkarsa henüz belli değil. Bu iyi bir mühürlü 1 mcM çaplı akson terminaline giriş direnci GΩ aralığı içine iyi olması muhtemel olduğunu kaydetti değerdir. Bu nedenle, sodyum kanalları bile az sayıda açılması uyarma salgılanması kaplin arabuluculuk kalsiyum kanalları etkinleştirmek için terminalleri depolarize için yeterli olabilir. Bu kalsiyum kanalları konuda, kanıt, N ve P / Q-tip kanalları hipokampal CA1 ve başka bir yerde 8 vibrodissociated hazırlıklarında GABAerjik terminallerinde serbest katılmak olduğunu göstermektedir . Nörotransmitterler ve reseptörleri sayısına göre modülasyon ve iletim plastisite vibrodissociated nöronlar kullanarak 3,4,9 incelenmiştir. Gibi düzenleyici eylemler olduğu gösterilmiştir nörotransmitterlerin adenozin, GABA, serotonin, endokannabinoidlerin, vb 2,6,10,11,12. Buna ek olarak, endokannabinoid bağımlı inhibisyonu (DSİ) depolarizasyon indüklenen bastırma gibi kısa vadeli sinaptik plastisite, aynı zamanda bu hazırlık 2,11 açıklanan olmuştur . Bu bulgular, endojen nöromodülatör reseptör-aracılı ve trans-sinaptik sinyalizasyon birçok formları vibrodissociated hazırlık bozulmamış olduğunu göstermektedir. Vibrodissociated Hazırlık Kalsiyum Geçici ve Axon Terminalleri veziküler Yayın Yukarıda tarif EMCCD donanımlı inverted mikroskop kullanarak, vibrodissociated nöron bouton hazırlanmasında presinaptik terminaller kalsiyum transientler inceledik. Şekil 2 hipokampal CA1 piramidal nöron AM-esterleşmiş Fluo-4 ve sonraki postsinaptik boya seyreltme hücre yükleme gösterir. Spontan kalsiyum geçişlerini Şekil 6B ilgi alanları (ROI) olarak gösterilen bazı boya dolu BOUTONS görülmektedir. 1 mcM tetrodotoxin (TTX) Uygulama sonraki kalsiyum yükselir, kendiliğinden BOUTONS aktive voltaj kapılı sodyum akımlarının aktivasyonu ile aracılı olduğunu belirterek, bu kendiliğinden transientler ortadan kaldırır. Presinaptik terminalleri (Şekil 7A) karşılık ROI'ler ölçülen hızlı çözüm değişimi ile 40 mM, 10 mM ekstrasellüler KCl artırılması floresan artan üretir. Postsinaptik nöron aynı anda kayıt sIPSCs izlemek ve olay sıklığı yüksek-K + depolarizasyon (Şekil 7B) artış olup olmadığını belirlemek için kullanılır . SynaptopHlourin Thy1 organizatörü (spH21 fareler etiketli) kontrolü altında inşa ifade fareleri kullanılmıştır presinaptik BOUTONS vezikül füzyon görselleştirmek için. SynaptopHluorin bir moleküler yapı pHlourin (GFP gelişmiş pH duyarlılığı ile bir mutant) 12 Ekliptik vezikül ilişkili membran proteini (VAMP2) 13 ile bağlantılıdır. Bu düzenleme, nispeten daha asitli bir ortama floresan doyurur vezikül lümen pHlourin motifi situates. Vezikül füzyon üzerine, bu motifin veziküller / presinaptik terminaller uygun puncta floresan çıkan bir artış ile daha nötr ekstrasellüler ortama maruz kalmaktadır. SpH21 farelerden alınan hipokampal nöronların Vibrodissociation GABAerjik terminalleri (Şekil 8A) için beklenen boyutu ve konumu floresan puncta görünüm için izin verir. Uygulama yüksek K + - harici bir çözüm içeren bu terminallere floresan artar ve ekstrasellüler kalsiyum, 0.2 mM (Şekil 8B) azalır harici bir çözüm bulunması bu etkiyi bloke edilir . Böylece, floresan depolarizasyon kaynaklı artış, nöron bouton hazırlanmasında GABAerjik sinaps uyarma-sekresyon kaplin yansıtacak şekilde görünür. Presinaptik kalsiyum transientler ve nöron bouton hazırlık akson terminallerinde vezikül füzyon ölçmek için yetenek bize nöromodülatör istismar ve sinaptik plastisite uyarma-sekresyon kaplin ve ekzositoz / endositoz yer presinaptik mekanizmaları, ilaçların etkilerini incelemek için olanak sağlar. Bu teknikler aynı zamanda presinaptik işlevi ve modülasyon / plastisite, özellikle proteinlerin rolleri incelemek için, diğer moleküler araçlar ve genetik olarak fareler ile kombine edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 hipokampal CA1 bölgeden Vibrodissociated nöronlar DIC (A) Birleştirilmiş görüntüGAD65 fare nd yeşil floresan görüntüler. DIC görüntü (B) Floresan görüntü açıkça synaptophluorin (spH21) fare yeşil terminalleri yerleri göstermek için birleştirilir. Ölçeği bar = 10 mikron <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Kalsiyum göstergesi yükleme prosedürü: (A) tam hücre AM-esterleşmiş boya ile yüklü; (B) tam hücreli kayıt boya sulandırır; (C) terminalleri ilgi alanları (ok başları) olarak görünür. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 vibrodissociated nöronların presinaptik terminaller aynı anda tüm hücre kayıt ve kalsiyum görüntüleme için deney düzeneği şematik. EMCCD = elektron çarparak şarj cihazı birleştiğinde. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Temsilcisi dalga şekilleri gösteren (A) spontan eylem vibrodissociated CA1 nöron potansiyelleri ve (B) membran gerilimi yanıtları hiperpolarizan ve bir CA1 nöron akım kelepçe kayıtları güncel enjeksiyonları depolarizan. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 (A) CA1 piramidal nöron kendiliğinden IPSCs Temsilcisi dalga şekilleri. Bicuculline (20 mcM C) (BC) IPSCs gabazine (B 10 mcM) ya da bloke edildi. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 TTX spontan GABAerjik sinaptik iletim engeller ve vibrodissociated hipokampal hazırlık presinaptik kalsiyum geçişlerini ortadan kaldırır. (A) önce bir vibrodissociated nöron ve TTX uygulama sırasında Kayıt. Sıklığında azalma ve sIPSCs genlik unutmayın. (B) Kalsiyum transientler önce bir vibrodissociated nöron bir Fluo-4-yüklü presinaptik terminal ve TTX uygulama sırasında gözlenmektedir. Transientlerin tam kaybı unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig7.jpg" alt="Şekil 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7 Eşzamanlı kalsiyum gösterge görüntüleme ve yüksek K + stimülasyon etkilerini gösteren sIPSC tam hücreli kayıt. (A) Floresans Fluo 04:00 boya ile yüklü bir presinaptik bouton zamanla ölçülür. (B), sIPSC frekans ve genlik yüksek K + uygulama sırasında aynı anda artar. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig8.jpg" alt="Şekil 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 8"> Şekil 8 Ca 2 +-bağımlı yüksek K + yanıt hipokampal CA1 bölgeden spH21 piramidal nöron presinaptik BOUTONS. (A) vibrodissociated bir nöronun Floresan görüntü. (B) High-K + uygulama (siyah çubuk ile gösterilir) normal ekstrasellüler Ca 2 + içeren bir çözüm (2 mM Ca2 +) varlığı floresan sürekli bir artış ile sonuçlanmıştır . Düşük ekstrasellüler Ca 2 + (0.2 mM Ca 2 +) floresan artış gözlenmiştir. Grafik veri ön-yüksek-K + floresan seviyeleri normalize ve 3 BOUTONS ortalama tepki göstermek.

<ol><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li>
<li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques%3A+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li>
<li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li>
<li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li>
<li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li>
<li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li>
<li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li>
<li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron%2Fbouton+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li>
</ol>

Başarılı vibrodissociation dilim sağlıklı nöron içeren ve interstisyel alanlarda nöronlar dilim toksik zarar vermeden çıkmak için izin verecek kadar esnek olduğunu gerektirir. , Sağlıklı bir dilim yetişkin beyin dilimleri daha az glial / interstiatial malzeme ile yapılabilir Böylece, tekniği, erken postnatal yaşları (P1-21) en iyi çalışır. Ancak, deneyimlerimiz nöronal hayatta kalmak için, kendisi vibrodissociation tekniği için ters olabilir dilim dilim hazırlık optimize. Biz rutin sakaroz çok ekstrasellüler Na + ve Ca 2 +, vibrodissociation için hazırlanan dilim normal kayıt aCSF hazırlanabilir (örneğin kesme) ikame edildiği soğuk değiştirilmiş aCSF kullanarak yerinde kayıt dilim hazırlamak Oysa. , Dilim kendilerini kayıt için bireysel nöronlar dilim hazırlanırken biz de 35 ° C sadece kesit sonra, normal aCSF dilimleri yerleştirin ve oda sıcaklığında onları dönmeden önce bu sıcaklıkta 30-60 dakika bırakın. Ancak, vibrodissociation için hazırlanan dilim sadece dilimleme sonra oda sıcaklığında hemen taşınır. Bu prosedürler, belki de nöronlar dilim kendisinden daha kolay gevşek çalkalanmalıdır sağlayan firma interstisyel doku eksikliği nedeniyle, vibrodissociation sonra sağlıklı nöronlar, bir daha yüksek verim sağlar. Biz rutin olarak, belirli bir günde kayıt ve görüntüleme deneyleri için yeterli nöronlar elde ince ayrıntısına kadar, dilim hazırlama koşulları incelenmiş değil. Kesit kalınlığı değişiklikleri veya preincubaton prosedürleri gibi ek değişiklikler, sağlıklı nöronların verimi artırmak için yapılmış olabilir mümkündür. Çok hafif proteaz tedaviler, hücre verimi artırmak ve yaşlı hayvanlarda çalışma tekniği almak için bir çaba içinde denenmiştir. Ancak, kaçınılmaz hatta hafif proteaz tedavi sinaps işlevini bozabilir görünüyor. Böylece, ise proteaz ve mekanik disosiasyon hala bugüne kadar ön beyin nöronları güvenilir kanıtlanmış değil çalışmak için bulunabilir kombinasyonu. Vibrodissociation teknik ağırlıklı çalışmak için bol miktarda nöron alt tipleri, özellikle projeksiyon nöronları yararlı olduğu anlamına gelir sonra sağlıklı nöronların nispeten düşük verim de dikkat edilmelidir. Kullanılabilirliği GFP ifade küçük nöronal alt popülasyonlar kolayca tespit edilebilir olan fareler bu nadir nöronlar eğitim şansını arttırır. Ancak, nöronal verim artırılabilir sürece bu nöronların veri birikimi önemli ölçüde göreceli olarak yavaş olması muhtemeldir. Birkaç adım kalsiyum algılama boyalar ile nöronların başarılı bir yükleme için çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. AM-esterleşmiş boya maruz kalma, 37 ° C&#39;de yapılır ve daha düşük sıcaklıklarda boya-yük çalışırken başarısız olmuştur. Boyaların konsantrasyonu boya yükleme daha yüksek konsantrasyonda presinaptik BOUTONS kalsiyum konsantrasyonunu düşürür görünür beri yükleme süresi ve sıcaklığı göz önüne alınarak optimize edilmelidir. Biz yüksek konsantrasyonlarda yükleme sIPSCs frekans ve genliği azaldığını gözlemledik. Yüklerken kalsiyum algılama vibrodissociated nöronların presinaptik terminalleri içine boyalar, bakım, küçük bir presinaptik BOUTONS tampon kapasitesi soma daha farklı olabilir, çünkü alınan ve BOUTONS boyutları tutarlı değildir olmalıdır. Nöron içeren yemekler boya yükleme aşağıdaki Hepes tamponlu harici çözüm ile yıkanır ve yıkama sonrası iyileşme süresi çok önemlidir. Buna ek olarak, tüm hücre kayıt için iyi bir mühür yapmak, hücreler, dış hücre membranı olmayan içselleştirilmiş boya moleküllerinin kurtulmak için iyice yıkanır olması gerekir. Elektrofizyoloji ve canlı hücre görüntüleme için vibrodissociated nöronlar kullanmanın yanı sıra, bu hücrelerin 11,12 immünositokimyasal teknikleri de uygulanabilir. Hücreler kolayca sabit ve çeşitli antikor ve diğer hücre belirteçleri ile boyandı. Bu hücrelerin protein ekspresyonu GABAerjik presinaptik terminaller görünüm için temiz bir hazırlık sağlar. GABAerjik nöronlar özel yararlanıcı kontrol altında floresan proteinleri ifade fareler kullanma araştırmacı vibrodissociated hazırlık bireysel sinaptik terminalleri (Şekil 1) tanımlamanıza olanak sağlar. Bu tip Görüntüleme floresan işaretleri terminalleri lazer tabanlı mikroskopi ve STED gibi yeni teknikleri (Uyarım Emisyon tükenmesi Mikroskobu) ile morfolojik ölçümleri için izin verebilir. Sinaptik vezikül bisiklet rapor boya ile Görselleştirme hazırlanması da mümkündür. Akaike ve arkadaşları canlı hücreler 4 terminaller görselleştirmek için styryl boya, FM1-43 ile GABAerjik terminalleri etiketli. Ayrıca profil RNA ifade vibrodissociated içinde tek hücreli ters transkriptaz PCR gerçekleştirmek mümkün olmalıdırnöronlar. Bu teknik rutin hücre kültüründe yetişen enzimatik ayrışmış nöronlar ve nöronlar uygulanır.

<table><tbody><tr><td>Titreşimli Doku Kesici</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültür Kabı (35 mm)</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Cam Tabanlı Kaplar</td><td>Willco-dish</td><td>GWSB-5040 veya GWSB-3522</td><td>Görüntüleme için 0.16-0.19 mm cam kalınlığı</td></tr><tr><td>Piezo&amp;#8211;elektrik Manipülatör</td><td>EXFO</td><td>LSS-3000</td><td>Röle vb. de kullanılabilir</td></tr><tr><td>SD9 Kare Dalga Stimülatörü</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9K</td><td>Piezo&amp;#8211;elektrik manipülatörünü tetiklemek için</td></tr><tr><td>Diseksiyon Stereoskopu</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>TYP 374590</td><td>Herhangi bir stereoskop da kullanılabilir</td></tr><tr><td>Alevli/Brown mikropipet çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>İnce Duvarlı Cam Kılcal Borular</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW-150F-4</td><td>Alevle mühürlenmiş cam mikropipet ve patch mikropipet için</td></tr><tr><td>Altı Kanallı Perfüzyon Valf Kontrol Sistemleri</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 veya VC-6M</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon Hızlı Adım (Fast-Step)</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>20-63x objektifli Evirtilmiş Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>TS200 Diaphot</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon&lt;sup&gt;EM&lt;/sup&gt;+ DU-888</td><td></td></tr><tr><td>Excite Floresan Aydınlatma Işık Kaynağı</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120PC</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM kalsiyum indikatörü</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>F14201</td><td></td></tr></tbody></table>

kemirgen beyin dilimleri nöronlar vibrodissociation sinaptik İletim ve görüntü presinaptik terminalleri eğitim

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Merkezi sinir sistemi nöronları mekanik disosiasyon presinaptik BOUTONS ilgi izole nöron bağlı kalmasını avantaja sahiptir. Bu ekstrasellüler ve postsinaptik hücre içi ortamlarda iyi kontrol edilebilir koşullar altında sinaptik iletim muayene için izin verir. Vibrodissociation olarak bilinen proteazların olmayan bir titreşime dayalı bir tekniktir, mekanik izolasyonu için en popüler tekniktir. Mikropipet, küçük bir topu şeklinde yangın cilalı ucu ile P1-P21 kemirgen yapılan bir beyin dilim yerleştirilir. Mikropipet dilim yüzeyine paralel vibrasyonlu ve izole nöronların kurtuluş dilim kalınlığı boyunca indirilir. Izole nöronların vibrodissociation birkaç dakika içinde çalışmaya hazır. : Bu teknik, primer nöronal kültürlerin de dahil olmak üzere, beyin dilimleri ve enzimatik izole nöronların kullanımı üzerinde avantajları vardır; ekstraselüler ortamda üstün kontrol komşu hücrelerle etkisi; uygunluğu elektrofizyolojik ve görüntüleme çalışmaları için uygun, uygulanabilir, oldukça olgun nöronlar hızlı üretim ve geliştirilmiş dilim veya hücre kültürü hazırlanması nöronların göre tüm hücre kayıtları yer kelepçe; hızlı ilaç uygulaması ve toplam hücre superfusion kullanarak iyi kontrollü farmakolojik deneyler için. Bu preparat, sinaptik fizyoloji, farmakoloji, modülasyon ve plastisite incelemek için kullanılabilir. Gerçek-zamanlı görüntüleme, canlı hücreler ve BOUTONS hem de pre-ve postsinaptik elemanları vibrodissociated nöronlar da mümkündür. Pre-ve postsinaptik elementlerin moleküler bileşenlerin karakterizasyonu da immünolojik ve görüntüleme-temelli yaklaşımlar ile elde edilebilir.

Bu rapor gösteriyor bağlı presinaptik BOUTONS istinat bireysel canlı nöronların mekanik izolasyon için kullanılan bir tekniktir. Vibrodissociated nöronlar, hızlı üretim, mükemmel farmakolojik kontrolü ve komşu hücrelerden etkisi olmadan gelişmiş uzay-klemp avantajlara sahip. Bu yöntem, sinaptik elemanları ve yama klemp kayıt görüntüleme için kullanılabilir.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Merkezi sinir sisteminden nöronların mekanik olarak ayrıştırılmasının avantajı, presinaptik butonların izole edilmiş nörona bağlı kalmasıdır...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, komşu hücrelerin etkisini ortadan kaldırırken farmakolojik kontrole ve geliştirilmiş uzay klemplemesine (space clamp) olanak tanıyan, uçları koparılmış ancak yapışık kalmış sinaptik batonları koruyan nöronları izole etmektir. Bu işlem, ikinci bir adım olarak tekil nöronları izole etmek amacıyla, doğum sonrası P1 ile P21 günleri arasındaki sıçan veya farelerden, ilgili beyin bölgesini içeren akut beyin dilimleri hazırlanarak gerçekleştirilir. Akut dilimler bir kaba yerleştirilir ve alevle mühürlenmiş bir cam mikro pipet, ucu dilim boyunca hareket ettirilirken ilgili alan içinde titreştirilerek tekil nöronların serbest bırakılması sağlanır.Nöronların kabın tabanına yapışması için süre tanınır. Ardından, fibro-disosiye nöronları içeren kap; sinaptik fizyoloji, farmakoloji, modülasyon ve plastisiteyi incelemek, ayrıca canlı hücredeki pre- ve post-sinaptik elementlerin gerçek zamanlı görüntülemesini ve karakterizasyonunu gerçekleştirmek üzere bir mikroskoba taşınır; sık sızdırmazlık (tight seal) yöntemiyle tüm hücre kaydı (whole cell recording) ve floresan mikroskopi kullanılarak sinaptik yanıtların fizyolojik ve farmakolojik özellikleri ile presinaptik terminal fonksiyonundaki ilgili değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, beyin kesitlerinden, kültüre edilmiş nöronlardan ve enzimatik olarak disosiye edilmiş nöronlardan kayıt alma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yapışık olan sağlam sinaptik bağlantıların presinaptik elementlerin kontrolüne ve görselleştirilmesine olanak tanıması, nispeten kompakt postsinaptik yapının ise iyileştirilmiş voltaj klempi ve hücre dışı ortamın mükemmel kontrolünü sağlamasıdır.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler; hayvanın yaşı, vibrasyon parametreleri ve kesitteki ilgi alanı gibi çeşitli koşullara bağlı olarak sağlıklı nöron elde etme verimi önemli ölçüde değişebildiği için zorluk yaşayacaklardır. Ayrıca, hücre kayıtları geleneksel kesit kayıtlarına göre daha kısa süre devam eden bireyler olabilir. VI disosiasyon basamaklarında kesit boyunca hareket mesafesini ve derinliğini doğru şekilde tanımlamak zor olduğu için bu adımları öğrenmek güçtür; bu nedenle yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Beyin kesitlerini hazırlamaya başlamadan önce, yapay beyin omurilik sıvısı (CSF) baloncuğunu karbogen ile 15 dakika boyunca hazırlayın.Ardından, buna iki milimolar kalsiyum klorür ve bir milimolar magnezyum klorür ekleyin. P 1 ila 21 postnatal yaştaki bir hayvanı anestezi altına alıp başı kestikten sonra beyni çıkarın, ardından ilgi bölgesini kapsayacak şekilde istenen yönde kesin. Diseke edilen beyni bir tablaya sabitleyin ve A CSF ile dolu bir hazneye daldırın.Ardından hazneyi bir beyin dilimleyiciye yerleştirin ve titreşimli bir bıçak kullanarak beyni dilim başına 250 ile 400 mikrometre kalınlıkta dilimleyin. Dilimleri yapay BOS içine yerleştirin ve bir ön inkübasyon haznesinde en az bir saat boyunca karbogen ile havalandırın. Alevle mühürlenmiş bir cam mikro pipet hazırlamak için, önce Flaming Brown veya eşdeğer bir mikro pipet çekicisi ile iki mikrometre uç çapına sahip standart bir patch clamp mikro pipeti çekin.200 ila 300 mikrometre çapında erimiş bir küre oluşturmak için mikropipet ucunu yaklaşık iki saniye boyunca bunsen beki alevine tutun. Ardından, alevle mühürlenmiş yama pipetini, piezoelektrik bimorf röle veya eşdeğerde etkili bir cihaz kullanılarak 100 ila 200 mikrometre hareket mesafesiyle yanlara doğru hızla titreştirilebilen mikromanipülatör tutucusuna yerleştirin. HEPES tamponlu salin solüsyonunu hazırlayın.Çözeltiyi sodyum hidroksit ile pH 7.4'e ve sukroz ile ozmolariteyi yaklaşık 300 milli osmole ayarlayın. Ardından, 35 milimetre çapındaki bir kültür kabını HEPES tamponlu salin çözeltisi ile doldurun. Bir kesiti kültür kabına yerleştirin ve bükülmüş bir tel kullanarak 250 x büyütmede diseksiyon stereoskopu ile gözlemleyin.Hücreleri ayrıştırmak için kesiti kabın tabanına sabitleyin. Alevle mühürlenmiş mikro pipetin ucunu kesit yüzeyine yerleştirin. Mikro manipülatörü, ucun yaklaşık 100 mikrometre sapma mesafesiyle 10 ila 30 hertz frekansında yanal olarak titreşeceği şekilde etkinleştirin.Mikromanipülatör yardımıyla mikro pipet ucunu, 30 saniye içinde tüm derinliği kesecek şekilde kesitin içine indirin. İzole edilen nöron sayısını maksimize etmek için bu adımı gerektiği kadar tekrarlayın. Ardından, ucu kesitten çıkarın.Kesiti pensle alın ve çözelti içerisinde nazikçe sallayın. Ardından kesiti çözeltiden tamamen çıkarın. Hücrelerin kap tabanına çökmesi için en az 10 dakika bekleyin.Nöronları içeren kabı ters bir mikroskobun tablasına yerleştirin ve 1x ila 63x objektif ile görüntüleyin. Membranları pürüzsüz, kabarcıksız ve çekirdekleri saptanabilir ancak aşırı büyük olmayan nöronları arayın. Faz kontrast optikleri kullanılıyorsa, hafif sarımsı tonlu, ancak çok mavi olmayan faz parlaklığındaki nöronları arayın.İki ila dört mega ohm pipet ucu direncine sahip, alevli brown veya eşdeğer bir çekici kullanarak standart bir patch mikro pipet çekin. Sinaptik yanıtların ölçümü için sezyum klorür bazlı bir hücre içi solüsyonla veya intrinsik membran özelliklerinin ve aksiyon potansiyellerinin ölçümü için potasyum klorür bazlı bir hücre içi solüsyonla patch pipeti doldurun. Standart elektrofizyolojik teknikleri kullanarak nöron üzerinde whole cell patch clamp uygulayın.Öncelikle, boşluksuz bir veri toplama protokolü kullanarak spontan post-sinaptik akımları kaydedin. Ardından, hücre dışı moleküler içeriği değiştirmek amacıyla, minyatür post-sinaptik akımları kaydetmek için 200 nM hayvan veya tetrodotoksin ve/veya düşük kalsiyum içeren hücre dışı çözelti uygulayın. İlgilenilen ilaçlar, hedeflenen nöronun yakınına konumlandırılmış, uçları kare şeklinde eritilmiş cam bir tüpün kanallarından birine ayrı ayrı yüklenir.Tek bir namlu, solüsyon değişimine 10 ila 100 milisaniye boyunca izin vermek için yanal olarak hareket eden, step motor tahrikli bir mikromanipülatör aracılığıyla nörona maruz bırakılır. İndirilen bns'lere, kamera tabanlı veya çok fotonlu bir mikroskopta, yüksek sayısal açıklıklı bir objektif ile yüksek büyütmede bakın. Burada, bir elektron çarpan şarj bağlı aygıt kamerası ile yakalanan bir nöron ve bns görüntüsü gösterilmektedir.Voltaj klemp kayıtları sırasında, eksitasyon için kullanılan ışık kaynağının gücü, 1.0 nötr yoğunluk filtresi ve %12 çıkışa ayarlanmış bir iris filtresi ile %1.2'ye düşürülmüştür. Sezyum klorür bazlı hücre içi solüsyon ile, vezikül füzyonunu görselleştirmek amacıyla spontan sinaptik akımlar gözlemlenir. Presinaptik batonlarda, TH promoterinin kontrolü altında sinaptik florin konstrüktü eksprese eden fareler kullanılmıştır.Sinaptik florin, pH duyarlılığı artırılmış bir GFP mutantı olan ekliptik Florin'in, vezikül füzyonu üzerine veziküle ilişkili membran proteinine bağlandığı moleküler bir yapıttır. Bu motif, daha nötr olan hücre dışı ortama maruz kalır ve bunun sonucunda veziküllere ve presinaptik terminallere karşılık gelen punctalarda floresan artışı meydana gelir. Bu farelerden elde edilen hipokampal nöronların fibro disosiyasyonu, bu prosedür uygulanırken GABAerjik terminaller için beklenen boyut ve konumdaki floresan punctaların görselleştirilmesine olanak tanır.Sağlıklı nöronlara sahip olmak için sağlıklı kesitler elde ettiğinizden emin olmanız gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, akut beyin kesitlerinin hazırlanması, bu prosedürün takip edildiği süreçte önemli bir adımdır. Sinaptik butonlarda veya postsinaptik nöronlarda hangi proteinlerin ve mRNA türlerinin eksprese olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya veya tek hücreli RT PCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, sağlıklı izole nöronların nasıl elde edileceği ve bunların elektrofizyoloji ile gerçek zamanlı görüntüleme için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

vibrodissociation-neurons-from-rodent-brain-slices-to-study-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz, kemirgenler ve insan olmayan primatlardan farklı yaşlarda beyin dilimleri nöron gibi DII floresan boyalar, tanıtmak için, gen tabancasının kullanımını göstermektedir. Bu özel durumda, yetişkin farelerin (3-6 ay) ve yetişkin cynomologus maymunlar (9-15 yaşında) kullanın. Dr Lichtman laboratuvar tarafından açıklanan bu teknik,...

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

Video, fare beyin dilimlerindeki retinogenikülat ve kortikojenikülat sinapsların elektrofizyolojik kaydını açıklar. Dorsal lateral genikülat çekirdeği (dLGN) içeren dilimler bir kayıt odasına yerleştirilir. Retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) uyarmak ve retinogenikülat sinapsları araştırmak için optik kanal üzerine veya kortikal nöronları uyarmak ve kortikogenikülat sinapsları araştırmak için nükleus reticularis talami'ye uyarıcı bir pipet yerleştirilir. Stimülasyon üzerine, RGC'ler ve...

Fare Beyin Dilimlerinde Retinogenikülat ve Kortikogenikülat Sinapsların Elektrofizyolojik Bir Çalışması

Bu video, medial prefrontal korteks (mPFC) aksonlarını optogenetik olarak uyararak ve LEC'deki piramidal nöronların yanıtlarını kaydederek lateral entorinal kortekste (LEC) sinaptik verimliliği inceleme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyon ile birleştirir.

Sıçan Beyin Dilimlerinde Sinaptik Olayların Optogenetik Stimülasyonu ve Elektrofizyolojik Kaydı

Kaynak: McLeod, F.,  et al. Hipokampal Kemirgen Beyin Dilimlerinde Sinaps Yoğunluğunun Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017). Bu video, konfokal immünofloresan analizi kullanarak hipokampal beyin dilimlerinde sinaptik belirteçleri görselleştirmek için bir yöntemi göstermektedir. Dilimler, presinaptik ve postsinaptik belirteçleri hedef alan primer antikorlarla immün boyanır, ardından florofor konjuge sekonder antikorlar gelir. Etiketli belirteçler daha sonra sinaptik mimariyi kolokalizasyonları...

İmmünofloresan Kullanılarak Fare Hipokampal Dilimlerinde Sinapsların Mikroskobik Analizi

Presinaptik salım yüz zarında Ca2+ akımlarının kaydedilmesi, Ca2+ girişinin ve nörotransmitter salınımının kesin olarak anlaşılmasının anahtarıdır. Fonksiyonel izole retikülospinal aksonlar veren lamprey omuriliğinin akut bir ayrışmasını sunuyoruz ve bu da bireysel presinaptik terminallerin serbest bırakma yüz zarından doğrudan kayda izin veriyor.

Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Akut beyin dilimlerinde sinaptik olarak eşleşmiş nöronların yama-kelepçe kayıtları ve eş zamanlı hücre içi biyosit dolumu, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ilişkili bir analizine izin verir. Bu protokolün amacı, nöronal mikro devrelerden elektrofizyolojik kaydın temel teknik adımlarını ve bunların müteakip morfolojik analizlerini tanımlamaktır.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

Doğru bir şekilde belirlenmesi ve Hipokampal dilimleri ayirt kullanarak sinapslarda analiz için bir protokol bu makalesinde ana hatlarıyla.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Biz sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağılımı morfometrik analizi için yüksek çözünürlüklü elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu işleme prosedürleri açıklanmaktadır. Bu yöntemlerle elde edilen mikrografikler, diğer hücresel bileşenlerin bir dizi morfolojisi ve boyutsal yapısal ilişkilerini incelemek için de kullanılabilir.

Sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağıtımının Ultrastrik morfometrik analizi için yenidoğan Rat beyin dokusunun hazırlanması

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Bu protokol, fare beyninden son derece saf sinaptozomlar, sinaptik veziküller ve diğer sinaptik fraksiyonları elde etmek için sağlam ve ayrıntılı bir yöntem sunar. Bu yöntem, protein lokalizasyonunun ve fonksiyonunun kompartmanlı çözünürlükle biyokimyasal analizi de dahil olmak üzere sinaptik süreçlerin değerlendirilmesini sağlar.

Sinaptik Bileşenlerin Murin Beyinden İzolasyonu için Hücre Altı Fraksiyonasyonu

Öğrenin kemirgen beyin dilimlerinden vibrodissosiasyon ile canlı nöron izolasyonunu ve presinaptik butonların görüntülenmesini. Bu yöntem sinaptik fizyoloji ve farmakoloji çalışmalarında gelişmiş voltaj kelepçesi sağlar.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Daha fazla video keşfet