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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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In ovo 닭 배아의 전기 천공

Overview

전기기는 세포로 외국 유전 물질의 전달을 통해 유전자 발현의 조작을 허용하는 생물 의학 연구에 사용되는 기술이다. 보다 구체적으로, 오보 전기포기는 초기 개발병아리(갈루스 갈루스 국산)에수행되며, 계란 껍질 내에 함유되어 있다. 이 절차에서 DNA 또는 녹다운 구조는 먼저 표적 조직에 주입됩니다. 그러나, 유전 물질은 세포 내의 기능을 수행하기 위해 혈장 막을 관통할 수 없다. 이 문제를 해결하기 위해 전기장이 적용되어 멤브레인 안정성에 일시적인 중단이 발생합니다. 이 전기장은 또한 음전하 핵산이 혈장 막의 구멍을 통해 양전하 전극쪽으로 이동하여 DNA 또는 녹다운 구조를 세포로 효과적으로 유도합니다. 이 기술의 주요 장점은 유전 물질의 전달이 특정 발달 시점에서 격리된 세포 유형에 국한될 수 있다는 것입니다. 결과적으로, 개별 발달 사건을 통제하는 유전 기계장치는 검토될 수 있습니다.

이 비디오는 오보 전기화의 원리에 대한 개요를 제공하고 모세관 바늘, 전극 및 전기 포로이터를 포함하여 기술에 필요한 도구를 소개합니다. 절차를 수행하기위한 단계별 프로토콜은 또한 기술이 닭 배아에서 다양한 유전 적 조작을 수행하는 데 사용되는 방법의 몇 가지 매혹적인 예에 대한 논의 전에 제시된다.

Procedure

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전기 기공은 세포에 외국 유전 물질을 소개하는 데 사용되는 기술이다. 계란 내부 또는 오보 전기화에서 병아리 배아의 전기화는 유전 물질의 전달이 특정 조직 및 특정 발달 시점에 국한 될 수 있기 때문에 발달 생물학자에게 귀중한 도구입니다. 이 비디오는 오보 전기화의 기본 원리를 소개하고, 절차의 필수적인 단계를 설명하고, 이 기술이 개발 도중 생물학 프로세스를 공부하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 토론할 것입니다.

시작하려면 전기 포기의 기본 원리를 검토하여 DNA를 세포로 가져 가는 방법을 알아 봅시다.

첫째, 미세 주입은 관심있는 세포에 가까운 에서 DNA를 전달하는 데 사용됩니다. 그러나 DNA는 혈장 막을 관통하여 세포로 들어갈 수 없습니다.

이 문제를 해결하기 위해 멤브레인의 안정성을 방해하기 위해 전류가 적용되어 모공을 생성합니다. 이 전기장의 두 번째 결과는 양전극을 향한 음전하 DNA의 이동이다. 그 결과, 양성 전극에 가까운 주사 부위측의 세포만이 DNA에 감염된다.

이제 기본 원리를 알고 있으므로 전기 포레이션을 위해 배아를 준비하는 방법에 대해 이야기해 봅시다. 햄버거 해밀턴 단계 20 보다 더 오래 된 배아를 사용 해야 하는 경우, 그것은 당신의 병아리 껍질 의 외부 문화 하는 것이 좋습니다., 또는 ex ovo,향상 된 조직 액세스를 위해. 이 비디오는 껍질 내에서 또는 ovo에서개발 초기 배아에 수행 전기 화에 초점을 맞출 것이다.

우선, 계란은 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 37°C의 가습 된 인큐베이터에서 배양되어야합니다. 계란이 배양하는 동안 주사 및 전기 화를위한 도구를 준비하십시오. 먼저, 파이프 풀러와 0.5mm 유리 파이프를 당겨 모세관 바늘을 확인합니다. 파이프를 열려면 현미경 아래에 놓고 팁의 작은 조각을 끊습니다. 그런 다음 주입된 솔루션을 시각화하는 데 도움이 되는 염료뿐만 아니라 구조의 적절한 희석을 포함해야 하는 주입 솔루션을 준비합니다.

바늘 내의 유체의 움직임을 제어하려면 인간으로 구동되는 구강 파이프에 부착하십시오. 대안적으로, 바늘은 공기의 조정 가능한 압력 펄스를 제공하는 마이크로 인젝터에 로드 될 수있다. 주사 용액에 팁을 잠그고 부정적인 압력을 가하여 바늘을 채웁니다.

바늘 이외에, 당신은 또한 전극이 필요합니다. 이들은 어댑터에 의해 함께 고정 된 두 개의 노출 된 전선으로 구성됩니다. 한 쌍의 케이블은 전극을 전기 펄스 발생기 또는 전기 포레이터에 연결하여 펄스 지속 시간, 주파수 및 전압을 제어합니다. 핸즈프리 작동을 위해, 전기포레이터는 발 페달에 의해 활성화될 수 있다.

계란이 준비되면 껍질에 창을 자르고 행크스와 같은 생리적 소금 용액 몇 방울을 추가하여 배아가 건조해지는 것을 방지하십시오. 현미경의 밑에, 관심있는 조직이 바늘에 접근할 수 있도록 계란을 배치합니다. 이어서, 모세관 바늘로 배아를 관통하고 부드러운 압력을 가하여 용액을 전달한다.

이제 구체를 주입했기 때문에 전기 포기를 수행해야 할 때입니다. 전극을 배치하여 행크의 용액에 침수되고 관심 있는 조직이 그 사이에 중심이 되도록 합니다. 전류를 적용하려면 발 페달을 누르고 전극 주위에 형성되는 거품을 찾습니다.

전기포이션이 완료되면 배아에서 전극을 제거하고 70%의 에탄올로 닦아냅니다. 감염을 방지하기 위해 항생제로 보충 된 소금 용액 몇 방울을 추가하고 테이프로 창을 밀봉하십시오. 마지막으로, phenotypic 분석 전에 지속적인 개발을 위해 인큐베이터에 계란을 다시 놓습니다.

이제 우리는 오보 전기 화에서 모든 것을 배웠으니, 과학자들이 개발 연구에서이 기술을 적용하는 방법의 몇 가지 예를 살펴 봅시다.

시작하려면, 전기포기는 녹다운 구조의 전달에 의해 유전자 발현을 차단하는 데 사용될 수 있다. 이 예에서, 개발 신경관의 세포는 유전자 침묵 구조로 전포하였다. 배아는 개발이 허용되었고, 축축물 궤적 궤적을 정상 과 녹다운 샘플 사이에서 비교하여 축슨 지침의 유전 적 제어를 평가하였다.

반대로, 오보 전기포기는 단백질 인코딩 유전자및 프로모터를 포함하는 플라스미드를 도입함으로써 세포의 하위 집합에서 단백질을 발현하는 데 사용될 수 있다: RNA 폴리머라아제에 결합하여 전사를 개시하는 서열. 여기서 과학자들은 배아 뇌의 세포에 단일 유전자를 전달했습니다. 이 유전자의 단백질 생성물과 특정 신경 아류형의 마커를 모두 검출하는 조직 염색은 전기화 된 유전자가 신경 발달을 변화한다는 것을 보여줍니다.

형광 단백질을 인코딩하는 DNA 구조는 또한 개발 도중 세포 및 구조물을 시각화하기 위하여 전기화에 의해 소개될 수 있습니다. 이를 통해 척수 발달과 같은 복잡한 프로세스의 실시간 이미징을 통해 시간이 지남에 따라 세포 운동의 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.

당신은 단지 오보 전기화에 JoVE의 소개를 보았다, 병아리에 유전 물질을 전달하기위한 유용한 기술. 이 비디오는 전기 기공의 기본 원리, 병아리를 주입하고 전기 화하는 데 필요한 단계, 현재 발달 연구에서이 기술의 응용 프로그램에 대해 논의했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

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