Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Functionele evaluatie van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes
Chapters
Summary December 11th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Xenopus kikkervisjes bieden een uniek platform voor het onderzoek naar de functie van het zenuwstelsel in vivo. We beschrijven methodologieën voor evaluatie van de verwerking van olfactorische informatie in levende Xenopus larven bij fokken normaal of na blessure.
Transcript
Deze methode kan nuttig zijn om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van neurobiologie, zoals hoe presynaptische terminals in vivo functioneren. Het belangrijkste voordeel van deze reeks technieken is dat we gratis benaderingen tonen om de functie van reukpaden te gebruiken met Xenopus kikkervisjes als diermodel. Het demonstreren van deze procedure zal ik zijn, Beatrice Terni, en Paolo Pacciolla.
Begin met de transsectieprocedure door twee stukken cellulose kwalitatief filterpapier in 0,02% MS2 22-verdovingsoplossing te bevochtigen en onder het ontleden toepassingsgebied te plaatsen. Kies dan een kikkervisje uit de tank en dompel het onder in een schotel van verdovingsoplossing. De kikkervis moet stoppen met zwemmen binnen twee tot vier minuten.
Controleer op een goede verdovendering door de afwezigheid van een reactie op mechanische stimuli toegepast op het staartniveau met behulp van pincet. Plaats de verdoofde kikkervis op het filterpapier onder het toepassingsgebied. Plaats het dier met zijn rugzijde naar boven gericht, zodat hersenstructuren kunnen worden gevisualiseerd.
Voor gedragsmatige experimenten, gebruik veni schaar om beide zenuwen transect om alle geurige informatie die aan de reukbol te onderdrukken. Laad een poled glas pipet met twee microliters van calciumgroen een dextrine oplossing, en plaats het in de microinjector. Plaats een verdoofde kikkervis onder de ontledenmicroscoop op filterpapier, verplaats vervolgens de punt van de pipet in de belangrijkste holte van de neuscapsule en lever 0,15 tot 0,3 microliter van de kleurstof.
Laat de kikkervis twee tot drie minuten op zijn plaats. Druppel met behulp van een Pasteur pipet 0,02%MS2 22-oplossing op de meer vertroddlee delen van het dier om te voorkomen dat het wordt gedroogd. Breng het dier naar de hersteltank waar de kikkervis binnen 10 minuten of zo normaal moet zwemmen.
Observeer de florescentie op het niveau van de glomerulaire laag van de reukbol op de dag na de injectie. Bereid een verdoofde kikkervis voor beeldvorming door eerst het verwijderen van de huid boven de reukbol. Gebruik veni schaar om een laterale incisie te maken op de huid van de kikkervis aan de rand van het centrale zenuwstelsel op het niveau van de reukbol.
Vermijd het uitbreiden van de snede naar het tectum, die gemakkelijk kan worden geïdentificeerd door de locatie van de oogzenuw. Houd het dier vochtig door het toepassen van druppels van 0,02%MS2 22 oplossing met behulp van een Pasteur pipet dan knijp de gesneden huid met behulp van een pincet en trek het over het zenuwstelsel. Controleer succesvolle verwijdering door de afwezigheid van melanocyten boven de reukbol.
Plaats de kikkervis in de put van de cel bewaker gecoate schotel. Plaats een glazen deksel met een hoog vacuümvet om de bovenkant van het tectum tot het einde van de staart te bedekken. Zorg ervoor dat de olfactorische bol en placodes blijven blootgesteld aan het extracellulaire medium.
Vul de pitri schotel met Xenopus Ringer's oplossing met 100 micromolar tubocurarine om spiercontracties te voorkomen. Plaats de schotel met de kikkervis onder een rechtopstaande microscoop. Sluit het reservoir met de oplossing van Xenopus Ringer aan op de schotel met behulp van polyethyleenbuizen voor continue overvloed aan de oplossing van Xenopus Ringer.
Begin met het doorsluipen van de oplossing van Xenopus Ringer. Houd het niveau van de oplossing in de schotel constant gedurende het hele experiment. Voortdurend evalueren kikkervisje levensvatbaarheid door het observeren van de bloedcirculatie door de bloedvaten.
Begin live beeldvorming met behulp van een lage vergroting doelstelling om de kikkervis te visualiseren. Verplaats de micromanipulator as om de capillaire leveren van de geurige oplossing op de top van een neuscapsule, de vorming van een 90 graden hoek met de reukzenuw. Vind de reuklamp ipsilateraal in de neuscapsule.
Schakel over naar een hoogvergrotingwaterdoelstelling met een lange werkafstand. Controleer de florescentie emissie door I.Glomerular structuren moet duidelijk zijn. Begin met het pipetten van 20 milliliter verse aminozuuroplossing in een verhoogd reservoir.
Neem dan zes voedsel beroofd kikkervisjes uit hun behuizing tank, en plaats ze in twee liter schoon kikkervisje water om de blootstelling aan geurstoffen te minimaliseren. Plaats een aangepaste zes put schotel op een witte LED transilluminator. Vul elk goed met 10 milliliter kikkerviswater.
Plaats een kikkervis per goed, laat dan rusten voor ten minste drie minuten. Start beeldverwerving en verwerf films die basale, stimulus- en herstelperioden bevatten. Een aantrekkelijke respons kan worden gedetecteerd als een beweging naar het mondstuk leveren van de oplossing van aminozuren.
Breng dieren terug naar hun tank na beeldvorming. Het bijhouden van kikkervishoofdposities binnen een gebied van 35 millimeter bij 35 millimeter, of de gelijkwaardige grootte in pixels, maakt een kwantitatieve analyse van reukgeleid gedrag mogelijk. De stippellijn vertegenwoordigt het proximale gebied aan de geuroplossinginlaat.
Individuele percelen kikkervisbewegingen worden geconstrueerd met behulp van X Y-coördinaten verkregen door beeldanalyse. De geëxtraheerde beweeglijkheidspercelen moeten getrouw videobeelden reproduceren. Een gebied van belang van 8.75 millimeterstraal gecentreerd op de oplossingsinlaat wordt gebruikt om de nabijheid van de dieren aan de geurige bron te classificeren.
Meer tijd doorgebracht in de buurt van het mondstuk van de geurstof duidt op positief tropisme. Tijd doorgebracht door kikkervisjes in de buurt van het mondstuk tijdens bepaalde periodes, bijvoorbeeld, 15 seconden intervallen, maakt het mogelijk identificatie van de mogelijkheid om aminozuur oplossingen te detecteren. Het algemene gedrag van een populatie kikkervisjes kan worden verkregen door de verdeling van individuele gegevens in kaart te brengen.
Positief tropisme kan worden gedetecteerd wanneer de aminozuuroplossing wordt bereid bij een millimolar of 160 micromolar. Dieren reageren niet op watertoepassingen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals histologische technieken of elektrofysiologie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijziging van synaptische eigenschappen na letsel.
Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van neurobiologie om de verwerking van reukinformatie in Xenopus-kikkervis te onderzoeken.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
