Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En effektiv strategi for å generere vev-spesifikke binære transkripsjon systemer i Drosophila av genomet redigering
Chapters
Summary September 19th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her presenterer vi en metode for å generere vev-spesifikke binære transkripsjon systemer i Drosophila ved å erstatte den første koding ekson av gener med transkripsjon drivere. Metoden CRISPR/Cas9-baserte steder en transactivator sekvens under endogene regulering av et erstattet gen, og dermed muliggjør transctivator uttrykk i genet-spesifikke spatiotemporal mønstre.
Transcript
Det overordnede målet med denne metoden er å generere et svært vevsspesifikt målrettet uttrykkssystem. I denne metoden demonstrerte vi generering av en binær transkripsjonsdriver som er spesifikk for vår Drosophila FGF homolog, branchless. Dynamisk, spatiotemporal uttrykk for branchless regulerer gren hemogenese av trakeal luftveiepitelet.
Selv om denne metoden kan gi innsikt i det spatiotemporale uttrykket og migrasjonen av grenløse produserende celler, kan den enkelt brukes på andre gener og vev i Drosophila eller i andre modellorganismer, som C.Elegans og sebrafisk. Den største fordelen med denne teknikken er at den genererer uttrykkssystemer som er svært pålitelige, vevs- og genspesifikke, og aktive utelukkende i celler der cis regulatoriske elementer av det erstattede genet er funksjonelle. Binære transkripsjonssystemer er viktige verktøy for målrettet genuttrykk og manipulasjon.
En transaktivator, for eksempel GAL4 eller LexA, uttrykt under kontroll av cis regulatoriske elementer i et gen, driver et effektortransgen som er plassert nedstrøms av spesifikke transkripsjonsbindingssteder, som UAS for GAL4 og/ eller LexO for LexA. Denne metodikken erstatter den første kodeutsen av det grenløse genet med transkripsjonsdriveren. CRISPR Cas9-baserte metoden plasserer en LexA transaktivatorsekvens under endogene regulering av det grenløse genet, og letter derfor transaktivatoruttrykk utelukkende i grensløse spesifikke spatiotemporale mønstre.
Begynn med å velge to RNA-målområder som spesifikt retter seg mot to ender av det valgte interesseområdet. Åpne crispr-designverktøyet du ønsker. Fly CRISPR Optimal Target Finder brukes her.
Klikk på Velg Genome'sett inn sekvensen av interesse, og velg den nyeste opplastede Drosophila melanogaster genom merknad, for tiden R understreke seks, i rullegardinmenyen. Deretter klikker du velg føringslinjelengde og skriver inn 20. Velg Alle CRISPR-mål, og klikk på Finn CRISPR-mål.
Evaluer alle RNA-mål for kandidatveiledning ved å angi maksimum for stringency og NGG only'for PAM. Hvis du vil generere en tandemguide RNA-uttrykksvektor, forsterker første PCR et DNA-fragment for å introdusere to proto spacer-sekvenser i en pCFD4 RNA-uttrykksvektorrad. Bruk en fremover og omvendt primer, hver med en proto avstandssekvens, og overlappe med pCFD4 vektorsekvensen i en PCR ved hjelp av høy-fidelity polymerase og pCFD4 mal DNA.
For å forberede pCFD4 for kloning, fordøy plasmid med Bbs1 enzym. Sett opp en reaksjon i riktig fordøyelsesbuffer som inneholder to til fem mikrogram pCFD4 plasmid og en mikroliter Bbs1-enzym og et endelig volum på 50 mikroliter. Bland reaksjonsinnholdet ved å gentling tappe røret og samle alle spredte dråper fra veggen av røret til bunnen med et kort spinn.
Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 grader Celsius i to timer etter å ha kjørt PCR-produktet og fordøyd plasmid på en en prosent agarose gel. Rens 6,4 kilobasepar lineær plasmid og 600 base pair PCR-produkt ved hjelp av standard gelrensingskolonner. Sett opp DNA-monteringsreaksjonen i henhold til produsentens protokoll.
For genomisk knock-in av en GAL4- eller LexA-sekvens, design en dobbelttrådet HDR-donor som inneholder transaktivatorsekvensen, flankert av to homologiarmer. For å unngå re-målretting av guiden RNA til den konstruerte locus, design erstatning donor på en slik måte at guiden RNA anerkjennelse nettsteder er forstyrret av eksogene sekvensen introdusert. For å unngå å endre renheten til cis-regulatoriske elementer, velg alltid guiden RNA-gjenkjenningsnettsteder i kode exon-regionen.
Planlegg DNA-monteringsstrategien for å bli med fire segmenter sammen for å generere en erstatningskassett. De fem prime og tre førsteklasses homologi armene, den midterste eksogene trans aktivator DNA-sekvensen, og lineærisert kloning vektor ryggrad. PCR forsterker en GAL4- eller LexA-uttrykkskassett fra en passende vektor og PCR forsterker homologiarmene fra det genomiske DNA-et som er hentet fra den overordnede flylinjen som er valgt for injeksjon.
Bruk high-fidelity polymerase i hver PCR for å generere målfragmentene. For å sette opp DNA-monteringsreaksjonen, bland den lineære kloningsvektoren og målfragmentene som genereres av PCR-kloning med DNA-monteringsmastermixen og et endelig reaksjonsvolum til 20 mikroliter i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber reaksjonsblandingen i en time ved 50 grader Celsius.
Når Nos-Cas9 embryoer tidligere injisert med både guiden RNA uttrykk plasmid og erstatning donor, utvikle seg til voksne, kryss G0 flyr individuelt for å balansere fluene fra en linje som passer for målrettet allele. Bedøve F1 avkom fra hvert G0 kryss på en karbondioksidpute. Tilfeldig plukke 10 til 20 menn under et stereomikroskop.
Individuelt krysse hver valgt mann til en balanserer kvinne fra en linje som passer for målrettet allele. Når F2 larver klekkes, velg F1-faren fra hvert kors. Trekk ut genomisk DNA ved å squishing hver flue i 10 til 15 sekunder med en pipettespiss, som inneholder 50 mikroliter squishing buffer uten å dispensere bufferen.
Deretter dispenserer du den gjenværende bufferen inn i røret og blander godt. Inkuber ved 37 grader Celsius i 20 til 30 minutter. Etter inkubasjonen plasserer du rørene i 95 grader Celsius varmeblokk i ett til to minutter for å inaktivere proteinase K.Etter å ha snurret ned i fem minutter ved 10 000 ganger G, oppbevar preparatet på fire grader Celsius for videre PCR-analyse.
Utfør tre-trinns PCR-baserte skjermer ved hjelp av primere fremover en og reversere en til skjermen for eksistensen av innsetting eller erstatning. Utfør PCR ved hjelp av to forover og reversere to primere for å bekrefte innsetting eller utskifting fra de tre prime regionen. Utfør PCR ved hjelp av primere M13F og reversere tre for å sjekke end-in'HDR.
Hold flylinjene med den bekreftede ends-out'HDR og etablere balanserte aksjer fra F2-generasjonen. Kryss ut av balansereren flyr igjen for å fjerne utilsiktede mutasjoner på andre kromosomer. Branchless, eller bnl uttrykk, er vist her i rødt i den tredje instar larver vingeplate, med reseptoren andpusten uttrykke celler, vist i grønt, i den voksende luft sac primordium.
Branchless expressing celler er vist her i TR5 tverrgående bindegren og TR2 dorsal gren. Andpusten uttrykke trakealceller er vist her i grønt. Andpusten uttrykkende celler er vist i grønt, merking den utviklende embryonale luftrøret fra trinn ni til trinn 14 og de grenløse uttrykkscellene er vist i rødt.
Dette bildet viser grenløst uttrykk indusert i ektopiske vevssteder under hypoksiske forhold, i forhold til kontroll. Denne metoden ble designet for å beholde alle de opprinnelige spatiotemporale forskriftene for grenløs gentranskripsjon. Derfor var det viktig å erstatte bare den første kodeeksonen av genet med LexA transaktivatorkodingssekvensen.
Etter utviklingen banet dette nye genetiske verktøysettet veien for å utforske nye vevsuttrykksmønstre i det grenløse genet. Det gjorde det også mulig å misuttrykk av gen og slått ned utelukkende i grenløse uttrykke celler og bidro til å overvåke lineær migrasjon og signalisere interaksjoner av cellene.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
