Laser-assisted Lentiviral gen leverans till mus befruktade ägg

Detta är en alternativ och lättanvänd metod för att leverera gener av intresse för befruktade musägg via laserperforering av zona pellucida och lentiviral genleverans. Laserassisterad perforering av musdonatorförfarandet kan också vara tillämpligt på andra arters befruktade ägg för att underlätta inträde av andra typer av virus eller reagenser för transfektion. Den största fördelen med denna teknik är att det inte kräver några specialiserade färdigheter för mikromanipulation och mikroinjektion av de befruktade musäggen.

Visar befruktade mus ägg isolering förfarande kommer att Page Myers, en forskare från jämförande medicin gren vid NIEHS. 16 till 24 timmar efter parning, isolera äggstockarna och ägggångarna från kvinnliga möss med vaginala pluggar, enligt standardprotokoll. När alla vävnader har samlats in, riva ampulla av varje äggstock isär, och släppa de befruktade äggen, omgiven av cumulous celler, och överföra äggen i cumulous celler till en 35 millimeters maträtt som innehåller en x hyaluronidase i färskt M2 medium, för en tre till fem minuters inkubering vid rumstemperatur.

Pipettera äggen några gånger för att frigöra cumulous celler, och överföra äggen till en ny 35 millimeter maträtt som innehåller M2 medium, med pipettering att tvätta bort enzymet. Därefter överför de tvättade äggen till en 35 millimeters maträtt som innehåller kalium simplex optimerat medium, eller KSOM, och pipetten för att tvätta bort de återstående M2-medium och hyaluronidase. Sedan överföra äggen till 35 millimeter vävnad-kultur behandlade plattor seedade med 50 mikroliter av KSOM och två milliliter dimetylpolysiloxan för en två timmars jämvikt vid 37 grader Celsius, 5%koldioxid och syre, och 90%kväve.

Medan äggen är i inkubatorn, ställa in och kalibrera XYClone laser, enligt tillverkarens rekommendationer. När äggen är klara, placera den första droppplattan på lasermikroskopet scenen, och manuellt fokusera zona pellucida. Efter att ha bekräftat att laser LED-ljuset är synligt genom målet, flytta mikroskopet scenen för att rikta zona med LED-laser, och använda datorns programvara för att ställa in XYClone laser till 250 mikrosekond.

Justera LED-ljusstorleken till lämpliga dimensioner, och perforera zona pellucida av varje ägg tre gånger med lasern för att producera tre 10-mikrometer hål. Det är avgörande att utföra perforeringen snabbt, men försiktigt, eftersom de befruktade äggen inte kan hålla utanför inkubatorn längre än 15 minuter. Sedan, returnera perforerade ägg till ruvmaskinen i ytterligare två timmar.

Vid slutet av den andra inkubationen behandlar du 50 mikroliter KSOM-droppen med två mikroliter av koncentrerat lentivirus utan att blanda. Och återlämna äggen till ruvmaskinen i fyra dagar. När äggen har utvecklats till blastocysts, använd en icke-kirurgisk embryoöverföringsanordning, för att deponera cirka 10-15 embryon i en cirka två mikroliter av KSOM.

17 dagar efter embryoöverföringen, låt den dräktiga musen föda naturligt eller samla in de nyfödda med kejsarsnitt vid behov. Sedan, samla vävnad från ungarna för genotypning, för att bestämma graden av transgenesis. Isolerade och transduced mus-befruktade ägg utveckling kan kontrolleras under mikroskop dagligen.

60 till 70% av friska, obehandlade embryon utvecklas till blastocysts inom tre till fyra dagar. Medan omkring 47%av laser-perforerade, transduced embryon utvecklas till blastocysts, 85%av vilka uttrycka den tranduced genen av intresse. Siktar lasern för att tunna zona, istället för att skapa ett hål, gör det möjligt för de växande embryon att dra nytta av en intakt, inkapsla zona pellucida samtidigt som den är tillåtande till lentiviral transduktion.

Transduktion med en rekombinant lentivirus, uttrycker copepod GFP från en töjning faktor 1A promotorn inducerar flera lentiviral integrationer, och ett högt uttryck för GFP under en blå LED-lampa. Samtidigt som man försöker detta förfarande, är det viktigt att komma ihåg att, medan förmågan hos lentiviruses att integrera i värdgenomet gör dem ett kraftfullt verktyg för stabil gen leverans, men slumpmässiga integration kan också införa insertional mutationer. Denna teknik skulle kunna göra det möjligt för forskare inom genetik att snabbt utveckla transgena djurmodeller för studier av sjukdom för in vivo proteinproduktion, eller för funktionella genstudier.

Efter detta förfarande, andra metoder som immunohistokemi kan utföras på isolerade vävnadsprover från transduced ungar att svara på ytterligare frågor om platsen och omfattningen av genuttryck i olika vävnader av intresse. Glöm inte att arbeta med lentivirus kan vara extremt farligt. Följ därför dina institutionella riktlinjer för arbete med lentivirus.

Använd personliga skyddskläder och sanera allt avfall före bortskaffande.