Biology
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基于细胞健康监测的实时细胞成像分析对低密度脂蛋白胆固醇的吸收检测
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Summary November 17th, 2018
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该协议提供了一种有效的方法来测量低密度脂蛋白胆固醇的吸收与实时流入率使用活细胞成像系统在不同的细胞类型。该技术提供了一个平台, 以筛选影响低密度脂蛋白流入的化合物的药理活性, 同时监测细胞形态, 从而潜在的细胞毒性。
Transcript
提出了一种对各种人体细胞类型低密度脂蛋白胆固醇吸收进行实时图像分析的方法。这允许筛选化合物，修改低密度脂蛋白胆固醇的运输。使用活细胞成像进行LDL流入定量的主要优点是，它允许在整个检测持续时间内监测细胞形态，从而可能检测出有毒化合物。
首先，从先前准备的细胞中吸走介质，用5毫升Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水清洗细胞。吸气 DPDS 。接下来从100毫米培养皿中分离出细胞，为 HepG2 细胞添加 1.5 毫升 0.25% Trypsin-EDTA，为 HK2 细胞添加 1.5 毫升 0.05% Trypsin-EDTA 溶液，或 HCAEC。
在37摄氏度下孵育板4分钟。然后，通过为 HepG2 和 HCAEC 细胞添加 3 毫升完整介质来中和 Trypsin。使用3毫升的胰蛋白素中和溶液，用5%的胎儿牛血清或FBS对HK2细胞进行妥协。
将细胞转移到15毫升锥形管中，然后在250g下离心管5分钟。旋转后，吸气介质，并在完整的介质中重新暂停细胞颗粒。通过 40 微米网状滤网轻轻过滤悬浮细胞，以分解细胞团。
在24井的板中，对细胞进行计数，并在优化的密度中对它们进行镀。在37摄氏度下孵育板，使细胞附着。第二天，将细胞介质更改为没有FBS的基介质，以进行细胞系，外加5%脂蛋白缺乏血清，或2%FBS介质。
在 24 井板中，每井使用 500 微升总介质。然后继续孵育24小时，使细胞挨饿。随着饥饿步骤或第二天，细胞可以处理所需的化合物和适当的控制。
饥饿24小时后，在每一个含有500微升介质的井中加入5微升的pHrodo红色标签LDL，获得每毫升10微克的最终浓度。小心地清除油井中的任何气泡。添加标记的 LDL 后，立即将板放在活细胞分析系统培养箱中，让板平衡 15 分钟，以减少板中的冷凝。
当细胞孵育时，打开软件，通过添加持有板的容器来安排扫描。每井拍摄 16 张图像，使用红色和相位通道以 10 倍放大倍率添加 1 小时间隔，4 小时。然后创建用于数据处理的板图，选择属性选项卡并选择板图。
在单元格选项卡中输入单元格类型，并在复合水龙头中进行处理。然后单击"区域"选项卡，选择每组复制，然后分配区域。实验运行完成后，在软件中创建一个映像集，以训练计算机量化计数集中包含的每个参数。
在软件中，打开板视图，然后在分析作业实用程序框中，选择创建或添加到图像集合。选择新的图像集合，为图像集合键入名称，然后通过选中通道旁边的复选框来选择红色和相位通道。从不同的井和时间点中选择另外五个图像，然后通过添加到当前图像集合将它们添加到图像集合中。
在分析作业实用程序框中，选择新的处理定义，从下拉菜单中选择图像集合，输入单元格类型的参数。在预览框中，使用下拉菜单选择预览所有。在分析掩码框中，选中汇合掩码和红色对象蒙版框以查看处理定义分析中包含的区域。
滚动浏览图像集合，以确保单元格和 LDL 包含在蒙版中。选择文件并保存处理定义。接下来，打开实验板视图，分析实验运行中的图像集。
在分析作业实用程序框中，选择启动新的分析作业，然后选择保存的处理定义。命名分析作业，选择分析时间范围，并突出显示要分析的实验井。选择启动按钮。
分析作业完成后，导出数据，选择已完成的分析并按视图。在实用程序菜单中，选择指标图导出。在区域菜单中，选择所有孔和组菜单，以获取每组井作为组的均值，选择"复制"。
要导出每个井的单个值，请选择"无"。在红色对象指标菜单中，选择总红色对象集成强度。选择数据导出按钮。
将数据分解为单个图像。数据会自动复制到剪贴板上，并可粘贴到新的电子表格文件中。在相位对象指标菜单中，选择汇合，然后单击数据导出按钮。
在提示选项卡中，将数据分解为单个图像。数据会自动复制到剪贴板上，并可粘贴到包含总红色对象集成强度数据的电子表格文件中。现在，根据协议的步骤 4.1.7 和 4.1.8，可以对导出的数据进行规范化，以获得最终的 LDL 吸收值。
在使用 Dynasore 或重组 PCSK9 进行治疗后，所有三个测试的人类细胞系在四个小时的过程中都显著减少了 LDL 的流入量。与用DMSO作为对照的细胞相比，在时间过程中，随着Dynasore的治疗，人类肝癌或 HepG2细胞的LDL流入量减少。不同时间点 HEPG2 细胞中LDL的活细胞成像显示，使用Simvastatin进行治疗后，LDL吸收率市场增加，支持这种方法的敏感性，以检测LDL流入的显著变化。
在初始时间点和最终终点调查的实时图像，确认 Dynasore 治疗后细胞的正常形态，表明该化合物的有效性和安全性。在细胞中加入更多红色标记LDL以保持其荧光活性后，保护板免受光线影响非常重要，直到它被放置在活细胞成像系统培养箱中。来自不同器官的细胞对治疗的反应可能不同，这意味着方向相反，或者它们可能以相同的方向作出反应，但胆固醇的摄取率不同。
只有通过活细胞成像才能发现和准确量化这些差异。
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