8,374 Views
•
11:21 min
•
November 20, 2018
DOI:
Этот метод может помочь классифицировать нейронные подтипы и расширить наше понимание функциональной карты корковых схем. Этот протокол был оптимизирован для сохранения ультраструктуры нейронов и получить отличное восстановление как дендритных, так и аксональных беседок, что позволяет высококачественные реконструкции. В конце электрофизиологической записи перенесите ломтик, содержащий записанную клетку, в небольшое блюдо ACSF.
Во время работы в дым капот, рулон ломтик на небольшой кусок тонкого качества фильтровальной бумаги и место еще один кусок увлажненной фильтровальной бумаги на ломтик. Поместите ткань в небольшой пластиковый горшок, содержащий от 5 до 10 миллилитров фиксаторного раствора и хранить при четырех градусах Цельсия на ночь. На следующий день перенесите ткань из контейнера с фиксаторным раствором в контейнер с двумя миллилитров 0,1 молярного фосфатного буфера для полоскания и отрежьте излишки ткани скальпелем лезвием.
Удалить избыток ткани, поместив ломтик в чашку Петри, и отрезать избыток ткани скальпелем лезвие. Перенесите обрезанную ткань в чистую чашку Петри, гарантируя, что она лежит ровной без складок или складок. Удалите лишний буфер с помощью сухой кисти краски.
Накройте ткань теплым раствором желатина и поместите чашку Петри на замороженный блок, чтобы быстро охладить раствор. Затем переместите блюдо установки желатина до 4 градусов по Цельсию в течение 30 до 60 минут. В дымовой капот, использовать лезвие скальпеля, чтобы вырезать небольшой, 1 X 1 сантиметр блок, содержащий желатин встроенной ткани.
Поднимите блок с помощью небольшого шпателя и тщательно перенесите на свежий фиксативный раствор. Разрешить исправить, по крайней мере 30 минут при четырех градусах по Цельсию. После этой второй фиксации, мыть желатин блок в пять миллилитров ПБ в три раза.
После мытья высушите блок с помощью листка бумажной ткани. Затем используйте небольшое количество цианоакрилатного клея, чтобы приклеить блок, ориентированный с тканью в верхней части, на вибромный грузовик с помощью супер клея. Раздел ломтик на 50 микрон толщиной с помощью вибромы и поместите каждый раздел тщательно в стеклянный флакон, содержащий 10 процентов сахарозы.
После секционирования, тщательно возьмите секцию из флакона и поместите его плоским в крышку чашки Петри. Затем используйте свежее лезвие скальпеля, чтобы удалить желатин со всего раздела. Поместите секции во флакон, содержащий 2 миллилитров свежей 10 процентов сахарозы в ПБ, и агитировать в течение 10 минут, чтобы начать процесс криопротекторной.
После криозащиты поместите секции плоскими на небольшой прямоугольник алюминиевой фольги с помощью кисти. Удалите излишки жидкости из секций и аккуратно сложите фольгу в посылку. Держите алюминиевую фольгу близко к поверхности жидкого азота, не касаясь поверхности в течение 30 секунд.
А затем позволить разделам оттаять полностью в течение примерно 30 секунд. Повторите заморозку оттепели еще два раза. Удалите все секции из фольги с кистью и поместите их в стеклянный флакон, содержащий два миллилитров ПБ, чтобы смыть избыток сахарозы под постоянным возбуждением.
После иммуностения для флуоресценции изображений, поместите слайд в стеклянную чашку Петри, содержащую PBS, и тщательно удалите крышку скольжения. Затем смойте секции со слайда с помощью нежных импульсов PBS из пипетки Pasteur. Поместите секции в чистый стеклянный флакон, содержащий PBS.
Выполните avidin HRP реакции, сначала инкубации разделов в Avidin биотин комплекса или ABC, по крайней мере два часа, чтобы усилить продукт реакции HRP. Далее, мыть разделы с PBS 3 раза в течение 10 минут, а затем с трис буфера дважды в течение 10 минут. После удаления последнего tris буфер мыть, быстро добавить одну каплю восемь процентов никеля хлорид решение diaminobenzidine решение или DAB решение.
Затем пипетка раствор в и из, чтобы смешать и быстро добавить один миллилитр этого решения по разделам. Инкубировать разделы в этом решении в течение 15 минут. Затем добавьте 10 микролитров 1 процента перекиси водорода в раствор DAB.
Разрешить реакцию, чтобы продолжить в темноте под постоянным возбуждением в течение примерно одной-двух минут, пока клетки помечены. В дымовой капот поместите небольшой круг фильтровальной бумаги в чашку Петри и смочите ее ПБ. Поднимите секции по одному из стеклянного флакона с помощью кисти краски и аккуратно поместите их плашмя на бумагу. Обложка разделов с другой увлажненный круг фильтровальной бумаги и удалить избыток буфера, мягко касаясь бумаги ткани на поверхность.
Нанесите восемь или девять капель одного процента осмия тетроксида в ПБ на верхнюю бумагу. Накройте блюдо и сохраняем в дымовом капюшоне не менее 30 минут, но не более 1 часа. После полоскания, монтажа и обложек секций, обезвоживание через ряд 50 процентов, 70 процентов, 95 процентов, и 100 процентов алкогольных растворов.
После шага обезвоживания перенесите секции на стеклянный флакон, содержащий 100-процентный этанол на шейкере в течение примерно пяти минут. Замените спиртовой раствор оксидом пропилена и промойте три раза в течение пяти минут. После последней стирки, держать около двух миллилитров оксида пропилена во флаконе и добавить смолы в соотношении 1:1.
Убедитесь, что смола растворяется и держать секции под постоянным возбуждением в течение 30 минут. Через 30 минут используйте деревянную палку, чтобы поместить каждый раздел в алюминиевый планхетт, содержащий эпоксидную смолу, и инкубировать на ночь. На следующий день поместите планчет на горячую тарелку примерно на 10 минут.
Затем возьмите каждый раздел с деревянной палкой и поместите на чистую горку. После того, как все секции были перенесены на слайд, просмотрите слайд под рассечением микроскопа, чтобы проверить ориентацию ломтиков и поместите крышку над секциями. Лечить в духовке в течение 48 часов при температуре 56 градусов по Цельсию.
Используйте цель низкого увеличения, чтобы сосредоточиться на домашней секции, содержащей тело клетки. Затем используйте цель 100x, сосредоточьтесь на клеточном теле и нажмите в центре, чтобы отметить точку отсчета. Чтобы проследить сому в 3D с помощью 100x цели, выберите контур из вкладки трассировки и выберите контур тела клетки.
Используйте джойстик, чтобы переместить фокус на самый верх клеточного тела. Поместите точки, нажав по периметру части, которая в настоящее время находится в фокусе. Нажмите правой кнопкой мыши и выберите близкий контур, чтобы закончить этот первый контур.
Повторите этот процесс в разных положениях z до тех пор, пока дно тела клетки не будет достигнуто. Чтобы проследить дендритную беседку, выберите дендрит или апический дендрит, в меню нейронов. Во-первых, проследите короткий начальный сегмент для каждого дендрита с помощью колеса прокрутки мыши, чтобы настроить диаметр курсора, чтобы соответствовать диаметру дендрита.
След вдоль каждого дендрита. Когда узел в дереве достигнут, нажмите правой кнопкой мыши и выберите раздвояющий узел или трифуркативный узел из меню высадки. Чтобы определить соответствующие точки между дендритами в разделе, который соответствует завершенной секции, нажмите на вкладку перемещения и выберите точки соответствия.
Выберите количество очков, необходимых для совпадают, а затем нажмите OK. Нажмите на окончание завершенной ветки, а затем нажмите на ветку. Повторите это для каждой точки матча. После того, как все дендриты каждого раздела были прослежены, проследить аксон с помощью того же процесса Показано здесь является реконструкция ячейки корзины CA2 с ограниченным дендритных и аксональных беседка с помощью рисования трубки.
Дендриты в черном, а аксон в красном. Это пример изображения биоцитина заполнены корзины ячейки после Avidin HRP протокол описано здесь. Здесь показано видео 3D нейронной реконструкции ячейки корзины CA2.
Дендриты в темно-розовом цвете, а аксон в белом. Наконец, на этом изображении показана дендрограмма ячейки корзины CA2. Это займет время, чтобы стать опытным с этим протоколом.
Тем не менее, этот оптимизированный подход может генерировать изображения высокого разрешения сложных корковых и гиппокамповых структур in-vitro.
Протокол, изложенные здесь описывает помощью иммунофлуоресцентного анализа, biocytin восстановления и реконструкции высокого качества гиппокампа CA2 интернейронов после внутриклеточных электрофизиологических записи в пробирке, позволяя нейронов Характеристика и в конечном итоге штраф нейрональных анатомии для изучения.
11:57
Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions
Related Videos
6591 Views
10:36
Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons
Related Videos
13535 Views
14:37
Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons
Related Videos
24406 Views
10:24
Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings
Related Videos
17167 Views
08:54
Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers
Related Videos
22901 Views
10:35
Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices
Related Videos
10628 Views
12:26
In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors
Related Videos
9324 Views
10:45
Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice
Related Videos
7130 Views
01:19
Immunostaining of Interneurons in a Rat Hippocampal Section
Related Videos
14 Views
01:26
Labeling of Biocytin-Filled Interneurons in Rat Hippocampal Slices for Visualization
Related Videos
29 Views
Read Article
Cite this Article
Economides, G., Falk, S., Mercer, A. Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons. J. Vis. Exp. (141), e58592, doi:10.3791/58592 (2018).
Copy