Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Biocytin восстановления и 3D реконструкций интернейронов заполненные гиппокампа CA2
Chapters
Summary November 20th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Протокол, изложенные здесь описывает помощью иммунофлуоресцентного анализа, biocytin восстановления и реконструкции высокого качества гиппокампа CA2 интернейронов после внутриклеточных электрофизиологических записи в пробирке, позволяя нейронов Характеристика и в конечном итоге штраф нейрональных анатомии для изучения.
Transcript
Этот метод может помочь классифицировать нейронные подтипы и расширить наше понимание функциональной карты корковых схем. Этот протокол был оптимизирован для сохранения ультраструктуры нейронов и получить отличное восстановление как дендритных, так и аксональных беседок, что позволяет высококачественные реконструкции. В конце электрофизиологической записи перенесите ломтик, содержащий записанную клетку, в небольшое блюдо ACSF.
Во время работы в дым капот, рулон ломтик на небольшой кусок тонкого качества фильтровальной бумаги и место еще один кусок увлажненной фильтровальной бумаги на ломтик. Поместите ткань в небольшой пластиковый горшок, содержащий от 5 до 10 миллилитров фиксаторного раствора и хранить при четырех градусах Цельсия на ночь. На следующий день перенесите ткань из контейнера с фиксаторным раствором в контейнер с двумя миллилитров 0,1 молярного фосфатного буфера для полоскания и отрежьте излишки ткани скальпелем лезвием.
Удалить избыток ткани, поместив ломтик в чашку Петри, и отрезать избыток ткани скальпелем лезвие. Перенесите обрезанную ткань в чистую чашку Петри, гарантируя, что она лежит ровной без складок или складок. Удалите лишний буфер с помощью сухой кисти краски.
Накройте ткань теплым раствором желатина и поместите чашку Петри на замороженный блок, чтобы быстро охладить раствор. Затем переместите блюдо установки желатина до 4 градусов по Цельсию в течение 30 до 60 минут. В дымовой капот, использовать лезвие скальпеля, чтобы вырезать небольшой, 1 X 1 сантиметр блок, содержащий желатин встроенной ткани.
Поднимите блок с помощью небольшого шпателя и тщательно перенесите на свежий фиксативный раствор. Разрешить исправить, по крайней мере 30 минут при четырех градусах по Цельсию. После этой второй фиксации, мыть желатин блок в пять миллилитров ПБ в три раза.
После мытья высушите блок с помощью листка бумажной ткани. Затем используйте небольшое количество цианоакрилатного клея, чтобы приклеить блок, ориентированный с тканью в верхней части, на вибромный грузовик с помощью супер клея. Раздел ломтик на 50 микрон толщиной с помощью вибромы и поместите каждый раздел тщательно в стеклянный флакон, содержащий 10 процентов сахарозы.
После секционирования, тщательно возьмите секцию из флакона и поместите его плоским в крышку чашки Петри. Затем используйте свежее лезвие скальпеля, чтобы удалить желатин со всего раздела. Поместите секции во флакон, содержащий 2 миллилитров свежей 10 процентов сахарозы в ПБ, и агитировать в течение 10 минут, чтобы начать процесс криопротекторной.
После криозащиты поместите секции плоскими на небольшой прямоугольник алюминиевой фольги с помощью кисти. Удалите излишки жидкости из секций и аккуратно сложите фольгу в посылку. Держите алюминиевую фольгу близко к поверхности жидкого азота, не касаясь поверхности в течение 30 секунд.
А затем позволить разделам оттаять полностью в течение примерно 30 секунд. Повторите заморозку оттепели еще два раза. Удалите все секции из фольги с кистью и поместите их в стеклянный флакон, содержащий два миллилитров ПБ, чтобы смыть избыток сахарозы под постоянным возбуждением.
После иммуностения для флуоресценции изображений, поместите слайд в стеклянную чашку Петри, содержащую PBS, и тщательно удалите крышку скольжения. Затем смойте секции со слайда с помощью нежных импульсов PBS из пипетки Pasteur. Поместите секции в чистый стеклянный флакон, содержащий PBS.
Выполните avidin HRP реакции, сначала инкубации разделов в Avidin биотин комплекса или ABC, по крайней мере два часа, чтобы усилить продукт реакции HRP. Далее, мыть разделы с PBS 3 раза в течение 10 минут, а затем с трис буфера дважды в течение 10 минут. После удаления последнего tris буфер мыть, быстро добавить одну каплю восемь процентов никеля хлорид решение diaminobenzidine решение или DAB решение.
Затем пипетка раствор в и из, чтобы смешать и быстро добавить один миллилитр этого решения по разделам. Инкубировать разделы в этом решении в течение 15 минут. Затем добавьте 10 микролитров 1 процента перекиси водорода в раствор DAB.
Разрешить реакцию, чтобы продолжить в темноте под постоянным возбуждением в течение примерно одной-двух минут, пока клетки помечены. В дымовой капот поместите небольшой круг фильтровальной бумаги в чашку Петри и смочите ее ПБ. Поднимите секции по одному из стеклянного флакона с помощью кисти краски и аккуратно поместите их плашмя на бумагу. Обложка разделов с другой увлажненный круг фильтровальной бумаги и удалить избыток буфера, мягко касаясь бумаги ткани на поверхность.
Нанесите восемь или девять капель одного процента осмия тетроксида в ПБ на верхнюю бумагу. Накройте блюдо и сохраняем в дымовом капюшоне не менее 30 минут, но не более 1 часа. После полоскания, монтажа и обложек секций, обезвоживание через ряд 50 процентов, 70 процентов, 95 процентов, и 100 процентов алкогольных растворов.
После шага обезвоживания перенесите секции на стеклянный флакон, содержащий 100-процентный этанол на шейкере в течение примерно пяти минут. Замените спиртовой раствор оксидом пропилена и промойте три раза в течение пяти минут. После последней стирки, держать около двух миллилитров оксида пропилена во флаконе и добавить смолы в соотношении 1:1.
Убедитесь, что смола растворяется и держать секции под постоянным возбуждением в течение 30 минут. Через 30 минут используйте деревянную палку, чтобы поместить каждый раздел в алюминиевый планхетт, содержащий эпоксидную смолу, и инкубировать на ночь. На следующий день поместите планчет на горячую тарелку примерно на 10 минут.
Затем возьмите каждый раздел с деревянной палкой и поместите на чистую горку. После того, как все секции были перенесены на слайд, просмотрите слайд под рассечением микроскопа, чтобы проверить ориентацию ломтиков и поместите крышку над секциями. Лечить в духовке в течение 48 часов при температуре 56 градусов по Цельсию.
Используйте цель низкого увеличения, чтобы сосредоточиться на домашней секции, содержащей тело клетки. Затем используйте цель 100x, сосредоточьтесь на клеточном теле и нажмите в центре, чтобы отметить точку отсчета. Чтобы проследить сому в 3D с помощью 100x цели, выберите контур из вкладки трассировки и выберите контур тела клетки.
Используйте джойстик, чтобы переместить фокус на самый верх клеточного тела. Поместите точки, нажав по периметру части, которая в настоящее время находится в фокусе. Нажмите правой кнопкой мыши и выберите близкий контур, чтобы закончить этот первый контур.
Повторите этот процесс в разных положениях z до тех пор, пока дно тела клетки не будет достигнуто. Чтобы проследить дендритную беседку, выберите дендрит или апический дендрит, в меню нейронов. Во-первых, проследите короткий начальный сегмент для каждого дендрита с помощью колеса прокрутки мыши, чтобы настроить диаметр курсора, чтобы соответствовать диаметру дендрита.
След вдоль каждого дендрита. Когда узел в дереве достигнут, нажмите правой кнопкой мыши и выберите раздвояющий узел или трифуркативный узел из меню высадки. Чтобы определить соответствующие точки между дендритами в разделе, который соответствует завершенной секции, нажмите на вкладку перемещения и выберите точки соответствия.
Выберите количество очков, необходимых для совпадают, а затем нажмите OK. Нажмите на окончание завершенной ветки, а затем нажмите на ветку. Повторите это для каждой точки матча. После того, как все дендриты каждого раздела были прослежены, проследить аксон с помощью того же процесса Показано здесь является реконструкция ячейки корзины CA2 с ограниченным дендритных и аксональных беседка с помощью рисования трубки.
Дендриты в черном, а аксон в красном. Это пример изображения биоцитина заполнены корзины ячейки после Avidin HRP протокол описано здесь. Здесь показано видео 3D нейронной реконструкции ячейки корзины CA2.
Дендриты в темно-розовом цвете, а аксон в белом. Наконец, на этом изображении показана дендрограмма ячейки корзины CA2. Это займет время, чтобы стать опытным с этим протоколом.
Тем не менее, этот оптимизированный подход может генерировать изображения высокого разрешения сложных корковых и гиппокамповых структур in-vitro.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
