Протокол, изложенные здесь описывает помощью иммунофлуоресцентного анализа, biocytin восстановления и реконструкции высокого качества гиппокампа CA2 интернейронов после внутриклеточных электрофизиологических записи в пробирке, позволяя нейронов Характеристика и в конечном итоге штраф нейрональных анатомии для изучения.
Как корковых сетевой активности процессов информация имеет важное значение для большого числа фундаментальных и клинических научных вопросов. Протокол, описанные здесь определяет основные строительные блоки этой схемы. Углубленные исследования корковых регионов будет в конечном итоге обеспечить другие ученые с компонентами цепи необходимы для понимания как мозг получает, обрабатывает и хранит информацию и что идет не так в заболевании, а электрофизиологических и морфологические данные широко используются вычислительные неврологи в строительство сетей модели, которые исследуют обработки информации. Протокол, изложенные здесь описывается как biocytin заполнены клетки, записанная в регионе CA2 гиппокампа оправился и затем реконструирован в 3D. Кроме того протокол описывает проявление кальция связывания белка или пептида контента в записанных интернейронов.
Коры головного мозга и гиппокампе являются структуры такой сложности, что классификация нейронов подтипы1,2,3,4, карты связей между ними5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 и как эта цепь поддерживает когнитивные функции12,13,,1415 находятся в стадии интенсивного исследования и предметом продолжающихся дебатов. Например, чтобы понимать детали и сложности схемы и координации данных, полученные из многих различных исследований, это очень полезно иметь возможность определить и описать компоненты, но она остается предметом обсуждения как много различных существуют классы нейронов, или даже является ли это можно определить все нейроны как принадлежащие к определенного класса. Вычислительные средства, которые можно построить и проверить схемы с разной степени сложности в настоящее время развитые16,17,18, но центральное место в этих усилиях является необходимость для детального изучения типов клеток и свойства соединений между ними. Уже собрано большое количество информации о местных схем коры головного мозга взрослых крыс с помощью протокола описаны здесь10,19,20,21, 22. Хотя «схема» является далеко не полным, некоторые ясные шаблоны или появились правила. Кроме того хотя некоторые детали различаются, эти правила являются общими для двух видов млекопитающих (крысы и кошка) и в нескольких регионах кортикальное, позволяя развития основные строительные блоки, которые могут быть в равной степени применимы к человека Неокортекс. Метод, описанный здесь используется для расширения нашего понимания функциональной карте корковых схемы путем выявления Пресинаптический и постсинаптических нейронов, участвующих в связи в регионах, которые не были изучены в деталях прежде, используя протокол что позволяет сохранение отличные ткани и замечательные окрашивание восстановления в ткани взрослого мозга. Путем объединения внутриклеточных электрофизиологических записи (парные записей с острыми микроэлектродов) с biocytin начинкой, с помощью этого метода были собраны данные о местных схем в CA2 и нейрональных свойства в этом вложенном иммунофлюоресценции, гистологические процедуры и высоко детализированные нейрональных реконструкций, позволяя прямое сравнение с соседними CA регионов23,24,25.
Метод, описанный в этой статье был разработан с годами для получения подробных нейрональных анатомии, позволяя правильной классификации клеток и высокое качество и точные реконструкций как их дендритных и аксональной беседок, данные, которые могут быть коррелирует с электрофизиологических данных, собранных из парных записей, используя острые электродов. Гистологические протокол оптимизирован для сохранения ультраструктуру нейронов и получить отличные восстановления дендритных (включая шипиков) и аксональной беседки. Например принцип двойной фиксации техники, во-первых окунет в фиксирующие решения и во-вторых, после фиксации в осмия тетраоксид дает хороший контраст для световой микроскопии26. Небольшое количество раствора пикриновой кислоты и глутаровый добавляются фиксирующие решение для улучшения проникновения антитела и сохранения ультраструктуру клетки как это было предложено в предыдущем исследовании27. Permeabilization срезы мозга с помощью метода замораживания оттаивания, в сочетании с крио защита с сахарозой, а не традиционные моющие средства, также обеспечивает оптимальное сохранение тканей для детального морфологического анализа записанных клеток. Кроме того визуализация особенно очень тонких структур повышается за счет уменьшения фон окраски, с инкубаций с перекисью водорода (H2O2) и натрия боргидрид (4NaBH). Добавление пероксидазы (ПХ) Хлорид никеля (NiCl2) реакция получить продукт реакции черный пигмент также увеличивает контрастность.
Следующий протокол описывает процедуры, используемые для выяснения отличные ткани сохранения и высоко детализированные нейрональных 3D реконструкций, после внутриклеточных записей в пробирке. Описание подготовки фрагмента, внутриклеточный парных записи с помощью острый электродов и последующего гистологического процедуры, используемые в нашей лаборатории были ранее сообщалось28. Хотя Протокол применяется к ячейкам внутриклеточно заполнены с biocytin в 450 — 500 мкм толстые ломтики, тот же протокол может использоваться после поклеточного записей. Однако использование более тонкие ломтики приведет к менее полной реконструкции клеток.
Электрофизиологические записей в пробирке (Рисунок 1 Ac,d и . до н.э., d) в сочетании с гистохимические и иммуногистохимическое процедуры включить подробную морфологии, содержание белка связывания кальция и личность взрослого корковых интернейронов записал чтобы быть выявлены. В регионе CA2, этот метод позволил изучение местных схем в первый раз и показал подклассы интернейронов, которые не были описаны ранее в СА1 или CA3: широкий дендритных и аксональной Арбор корзина клеток (рис. 1B), клетки bistratified и SP-SR интернейронов.
Протокол, описанные здесь была оптимизирована для сохранения ультраструктуру нейронов и получить отличные восстановления дендритных (включая шипиков) и аксональной беседки. Важнейшие шаги включает в себя использование метода двойной фиксации для повышения контраста для световой микроскопии26 и добавлением глютаральдегид и пикриновой кислоты решения фиксирующие решение для улучшения проникновения антитела и сохранения нейронов Ультраструктура27. Permeabilization нежный замораживания оттаивания дает лучшее сохранение тонкой структуры, osmication и смолы встраивание уменьшить z плоскости усадка28. Кроме того визуализация очень тонких структур (например, штраф аксоны с небольшой boutons) улучшается инкубации в разделах с H2O2 и4 NaBH для уменьшения фона пятнать. Можно также увеличить контраст с добавлением2 NiCl реакцией ПХ.
Гистологические процедура подробно здесь предлагает отличные результаты с точки зрения надежности и повторяемость. Однако продолжительность электрофизиологических записей будет определять качество biocytin/флуоресценции, окрашивание, короче записи обычно ассоциируется с плохой аксональное пятнать. Выбор записи протоколов (внутриклеточный записи с помощью резкое электроды против поклеточного патч зажима) могут также влиять biocytin удержание и сохранение тонкой анатомии.
Хотя трудности в сохранении тонкой структуры во время получения воссоздать на 100 крат (1-4weeks в зависимости от сложности аксон) и гистологической обработки, описанные здесь ценятся, этот метод дает точное представление дендритных и аксональной диаметров. Использование менее требовательных протоколов раскрыть маркировки biocytin понятно, однако, они часто препятствует четкой визуализации тонкой аксональное ветвей. Моющие средства, чтобы содействовать вступлению авидин-ПХ раскрыть biocytin и антител, часто необходимы в толстые секции, но может нарушить тонкой структуры. Неврологи Поиск постоянно для полуавтоматического методы восстановления, но для теперь и аксоны особенно, biocytin-HRP с ручного восстановления остается золотой стандарт31.
Очень подробные нейрональных реконструкции, особенно в точные чертежи аксональное boutons и узлы, наличия или отсутствия миелина и в целом рисунок полной аксональное Арбор, с представлением точной аксон диаметр изменяется вдоль его Длина, предоставить дополнительную информацию для точной идентификации отдельный тип interneurone. Хотя многие интернейронов может не поместиться точно в определенный класс, метод, описанный выше обеспечивает коррелированных данных нейрональных электрофизиологических свойств, краткосрочные пластичности связанные с определенным типом подключения и подробные нейрональных реконструкций, позволяя схема, в регионе CA2, например, необходимо изучить в деталях.
Штраф, подробная структура часто упрощена в вычислительных моделей. Хотя понятно, это приводит к потере информации, которая в будущем может оказаться критической. Анализ подробные 3D реконструкций с параллельной синаптических данных позволит добавление дополнительных критериев для классификации interneuronal. Данные можно на хранение в государственных хранилищах и используемые для моделистов вычислительно изучить итоги спорадические изменения в диаметре аксона и миелинизации на потенциал действия распространения.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование получил финансирование от Novartis Pharma (Базель) и Совет по медицинским исследованиям, присуждена проф Алекс Томсон, биотехнологии и биологических наук исследовательского совета (СИББН-BB/G008639/1), физиологического общества, Европейский союз Horizon 2020 Рамочная программа исследований и инноваций под конкретные Грант соглашение № 720270 (человеческий мозг проекта SGA1) и под конкретные Грант соглашение № 785907 (человеческий мозг проекта SGA2). Мы чрезвычайно признательны проф Алекс Thomson для настройки протокола в других регионах кортикального слоя, обеспечение финансирования и за ее постоянную поддержку для этого проекта. Взносы, сделанные членами лаборатории, которые помогли оптимизации восстановления протокол и реконструированы CA2 нейронов с благодарностью: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Хьюз, A. P. Баннистер, K. Истлейке, H. Тригг, н. а. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |