Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
MeshAndCollect kullanarak floresan Protein Cerulean yapı çözümü
Chapters
Summary March 19th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Biz kullanılmak üzere sonraki yapı belirlenmesi, kısmi kırınım veri kümeleri floresan protein Cerulean birçok küçük kristaller toplanan oluşan bir tam kırınım veri kümesi elde etmek için MeshAndCollect Protokolü'nün kullanılmasına mevcut.
Transcript
Otomatik MeshAndCollect protokolü, seri kristalografiile standart rotasyon veri toplamasını birleştirerek disk örneklerinden küçük kristalleri ölçmek için geliştirilmiştir. Yöntem, önce aynı numune tutucuya monte edilen kristallerin konumunu tanımlar ve daha sonra birleştirilecek ve yapının çözümü için kullanılacak kısmi veri kümesinin toplanmasını yönlendirir. MeshAndCollect hızlı ve aynı kurulum, yapı çözümü, ligand tarama ve tüm bu küçük kristaller ile deneyler yapmanızı sağlar gibi zorlayıcı.
Yöntem, senkrotron Beamline'ın vmx'i ile ideal olarak yüksek foton esneme, küçük bir ışın çapı ve hızlı yeniden yükleme dedektörü ile donatılmıştır. İlk olarak, protein kristalografisi beamline veritabanı için genişletilmiş bilgi sistemine bağlanın ve A formundan deney numarası ve şifre ile MX.Log'u seçin. Ardından, Gönderi Ekle Yeni'yi seçin ve istenen bilgileri doldurun.
Kısmi Ekle'yi seçin ve ilgili verileri doldurun. Kapsayıcı Ekle'yi seçin, bir SC3 diski seçin ve diskteki örnek tutucuların konumları da dahil olmak üzere gerekli bilgileri doldurun. Deney barakasında, diski örnek değiştirici doer'e yükleyin ve konumunu not edin.
Daha sonra, protein kristalografisi beamline veritabanı için bilgi sistemine giriş yapın. Deney Işey'i seçin, Gönderini bulun, İleri'yi seçin ve örnek değiştiricideki ışın çizgisi ve disk konumunu belirtin. A formunda verilen deneysel numara ve parolaile beamline kontrol yazılımına giriş yapın.
Protein kristalografisi beamline veritabanı için bilgi sistemi ile ışın hattı kontrol yazılımı senkronize etmek için Sync tuşuna basın. Örnek tutucuyu goniometer üzerine monte etmek için ışın çizgisi kontrol yazılımını kullanın. Ardından örnek değiştirici alanında bir konuma sağ tıklayın ve Örnek Dağı'nı seçin.
Orta düğmeyi seçin ve ardından döngünün ucunun kenarının ortasına üç tıklama merkezi açın. Kaydet'i seçerek ortalanmış konumu kaydedin. Gelişmiş altında, veri toplama kuyruğuna iş akışı Görsel Yeniden Yönlendirme'yi ekleyin.
Ardından Sıra topla'yı tıklatarak iş akışını başlatın. Ardından, üzerine tıklayarak kaydedilen merkez konumlarından birini seçin. Merkez düğmesine tekrar tıklayın, ardından döngünün sapının başlangıcının ortasında üç tıklatma merkezi.
Kaydet'e tıklayarak ikinci konumu kaydedin. Ardından Devam'a tıklayın. İş akışı, numune tutucunun düzlemini goniometrenin dönüş ekseniyle hizaladıktan sonra, numune tutucuyu kafesin ortasında bir yere tekrar ortaladı.
Numune tutucuyu, ışın hattı kontrol yazılımını kullanarak omega eksenini döndürerek kafesin yüzünün x-ışını nın yönüne dik olması için yönlendirin. Beamline kontrol yazılımında Diyafram açılır menüsüne tıklayın ve bir değer seçin. Ardından örgü aracı penceresini açmak için örgü araç simgesine tıklayın.
Işın çizgisi kontrol yazılımının örnek görünümünde, fareyi sol tıklatarak ve örnek tutucuda kristaller içeren alanın üzerine sürükleyerek kafesi çizin. Kafesi kaydetmek için, kafes aracı penceresindeki artı düğmesini tıklatın. Beamline kontrol yazılımının çözünürlük alanına, kırınım görüntülerinin toplanması gereken çözünürlüğü girin.
Kristallerin kırınım kalitesi hakkında önceden bilgi yoksa, iki ile 2,5 arasında bir değer önerilir. Gelişmiş veri toplama sekmesinde MeshAndCollect'i seçin. Kuyruğa ekleyin ve Sırayı Topla'yı tıklatın.
Parametre penceresinde, beamline bağımlı varsayılan parametreleri kullanın. Burada açıklanan deneyde, varsayılan parametreler kafes tonu noktası başına 0,037 saniye pozlama süresi, %100 iletim ve kafes tonu başına bir derece salınımdır. Devam'ı tıklatın.
Örgü tkamı çalışır ve her ızgara noktasında toplanan kırınım görüntüleri analiz edilir ve yazılım Dozer ile kırınım gücüne göre sıralanır. Dozer analizinden sonra bir ısı haritası oluşturulur ve sonraki kısmi veri toplama sırası kırınım gücüne göre otomatik olarak atanır. Son olarak, kısmi veri koleksiyonlarını başlatmak için Devam'ı tıklatın.
MeshAndCollect MXCuBE uygulanan olarak kristallerin görsel tanımlama zor olduğu aynı örnek tutucu üzerinde bulunan Cerulean küçük kristaller kısmi kırınım veri kümelerinin toplanması için kullanılmıştır. Örnek tutucuyu taramak için, örgü döngünün ortasına bir ızgara çizildi ve Dozer skor ısı haritasına göre 85 kısmi kırınım veri seti otomatik olarak toplandı. Bunlar tek tek entegre edildi ve 1,7 angstrom çözünürlüğünde %99,8 bütünlüklü bir veri seti üretmek üzere birleştirildi.
Beklendiği gibi, Cerulean kristal yapısı oluşturulan veri seti kullanılarak moleküler değiştirme ile çözülebilir. Arıtma dan sonra %22.8 R ve %25.4 r ücretsiz çalışma elde edildi. Daha önce belirlenen yapının süper konumu 0.1 angstroms c-alfa pozisyonları üzerinde küresel bir RMSD gösterir.
Kristal büyüme aşamasının optimizasyonu yapılan projelerde, MeshAndCollect küçük kristallerden elde edilen bu amorf kısmi veri kümelerinin birleşimine dayalı tam bir veri seti elde etme olanağı sağlar. Bu teknik, yapısal biyologların mikro kristallerin sadece onda birinin üretilemediği parça örneklerinden bir yapıyı çözmelerinin önünü açtı.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
