Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
CRISPR-medieret genom-redigering af menneskelige svampe patogen Candida albicans
Chapters
Summary November 14th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Effektiv genom engineering af Candida albicans er afgørende for forståelsen af patogenesen og udvikling af lægemidler. Her, beskrev vi en protokol for at hurtigt og præcist redigere C. albicans genom ved hjælp af CRISPR. Protokollen giver mulighed for efterforskerne at indføre en lang række genetiske modifikationer herunder punktmutationer, indsætninger og sletninger.
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at afsløre forskellene mellem svampe og pattedyr på molekylært niveau. Sådanne forskelle kan udnyttes til at identificere nye terapeutiske tilgange. Den største fordel ved denne teknik er, at det mere effektivt ændrer genomet af C.Albicans end klassiske homologe rekombinationsteknikker.
For at identificere guide RNA sekvens identificere en NGG PAM sekvens tæt på, hvor stop codon vil blive indsat. Vist her, er alle PAM sekvenser findes i de første 100 base par TPK2, en cyklisk AMP kinase katalytisk underenhed. Identificer den forreste guide primer tre sekvens.
Denne sekvens vil være 20 baser direkte opstrøms for en NGG PAM site og vil ikke indeholde mere end fem T's i træk. Venstre klik på basen direkte opstrøms for NGG og træk markøren 20 baser. Derefter venstre klik på primer fanen for at tilføje primer.
Nu identificere den omvendte guide primer tre sekvens, som vil være kompliment til den forreste guide sekvens. Venstre slikke på basen direkte opstrøms for NGG og træk markøren 20 baser. For hver primer, venstre klik på primer fanen for at tilføje primer.
Højreklik på primeren, og vælg kopiprimerdata. Indsæt sekvenserne i et tekstredigeringsprogram. Tilføj udhæng sekvenser til frem og tilbage guide oligos at lette kloning.
Tilsæt nukleotidsekvensen ATTTG til den fem primære ende af den forreste styres primer tre, og tilføj G til den tre primære ende af den forreste guide primer tre. Endelig ved nukleotid sekvens AAAAC til de fem primære ende af den omvendte guide primer tre og tilføje C til de tre prime ende af den omvendte guide primer tre før køb. Dye teste Candida optimeret cas9 udtryk vektor ved at tilføje pv1524, 10x buffer, bs9b1, og vand til 50 mikro liter i en 1,5 milliliter rør og inkubere ved 55 grader Celsius i 20 minutter.
Afkøl fordøjelsesblandingen til stuetemperatur og drej i 30 sekunder ved 2348 gange G for at bringe kondens til bunden af røret. Til fosfatase behandle fordøjet rygrad, tilsæt en mikroliter kalv Intestinal Phosphatase til fordøjelsen blandingen. Inkuber reaktionen ved 37 grader Celsius i en time før.
Nu, fosforlate og glødende fremad guide primer tre og omvendt guide primer tre, ved at kombinere dem med 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynukleotid Kinase, og vand i en PCR rør. Tilføj 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynukleotid Kinase, og Molekylær biologi Grade Vand til en anden PCR rør som en negativ kontrol. Inkuber reaktionsblandingerne i en thermocycler ved 37 grader Celsius i 30 minutter, derefter ved 95 grader Celsius i 5 minutter.
Cool blandingen ved den langsomste rampe sats til 16 grader Celsius at gløde oligos. Derefter inkubere den udglødede oligo blanding ved 4 grader Celsius. Nu ligate den udglødede oligos i fordøjet PV1524.
I det første PCR-rør tilsættes 10x T4 Ligase Buffer, t4 DNA Ligase, udglødet oligo mix, fordøjet CIP-behandlet renset plasmid og vand til en samlet volumen på 10 mikroliter. Tilsvarende forberede en anden PCR rør ved hjælp af den negative kontrol blanding i stedet for den udglødede oligo mix. Inkuber begge rør i en Thermocycler ved 16 grader Celsius i 30 minutter, derefter ved 65 grader Celsius i 10 minutter, og endelig afkøles til 25 grader Celsius.
Efter ligation omdannes ligationsblandingerne til kemisk kompetente celler, og plasmiderne renses og sekvenseres derefter som beskrevet i tekstprotokollen. Hvis du vil designe reparationsskabelonen, skal du indsætte en stop-codon ved at venstre klikke i gensekvensen og tilføje nukleotider, der koder et stop-codon- og begrænsningsfordøjelsessted. Venstre klik 10 baser nedstrøms for, hvor mutationen vil blive foretaget og trække markøren 60 baser opstrøms.
Venstre slikke på primer fanen for at tilføje primer. Dette vil tilføje reparationsskabelonen fremad tre. Derefter venstre klik 10 baser opstrøms for, hvor mutationen vil blive foretaget og trække markøren 60 baser nedstrøms.
Venstre klik på primer fanen for at tilføje primer. Dette vil tilføje reparationsskabelonen omvendt tre. For at generere reparation skabelon, tilføje reparation skabelon frem primer, reparation skabelon omvendt primer, deoxynucleotide tripfosfater, buffer, TACH polymerase, og vand til hver af de fire PCR rør.
Nu udføre primer udvidelse ved at køre mellem 20 og 30 runder af PCR. For at fordøje de korrekt klonede plasmider tilsættes plasmid, 10x Buffer, Bovine Serum Albumin, KPN 1, SAC 1 og vand til 40 mikroliters samlede volumen i et 1,5 milliliterrør. Inkubere ved 37 grader Celsius natten over.
I mellemtiden vokse en overnight kultur C.albicans SC5314, vilde-type prototroph, på 25 grader Celsius i uridine suppleret YPD. Dyrk kulturen til en optisk tæthed ved 600 nanometer eller OD 600 på mindre end seks. Pellet fem OD 600 enheder af celler pr transformation ved at dreje i fem minutter ved 2348 gange G.Derefter suspendere pelleterede celler i 100 mikroliter af TE / Lithium Acetat.
Nu, til en 1,5 milliliter rør og i orden, tilsæt re-suspenderet celler, kogte og hurtigkølet laks sperm DNA, plasma fordøjelsen, den rensede reparation skabelon, og plade buffer. Forbered en negativ kontrol på samme måde, bortset fra at erstatte vand ved et volumen svarende til den transformerende DNA. Efter inkubering af transformationer natten over, varme chuck cellerne ved at placere dem i en 44 grader Celsius vandbad i 25 minutter.
Spin i fem minutter ved 2348 gange G i en bænk top centrifuge og fjern pladeblandingen supernatant. Vask én gang ved at tilføje en milliliter Uridine suppleret YPD og centrifuge igen. Efter suspension af cellerne i 0,1 milliliter Uridine Suppleret YPD, inkubere suspensionen på en rulle tromle eller shaker ved 25 grader Celsius natten over.
Den næste dag, plade cellerne på Uridine Suppleret YPD med 200 mikrogram per milliliter nourseothricin. Kolonier vises om to til fem dage og skal stribes for enkelte kolonier som beskrevet i tekstprotokollen. For at udføre koloni PCR, designe en forward check primer omkring 200 base par op strøm af begrænsningen site, der blev indført, samt en omvendt primer ca 300 base par nedstrøms.
Tilføj 0,3 mikroliter af forward check primer, 0,3 mikroliter af omvendt check primer, 0,3 mikroliter af termotabel polymerase, tre mikroliter af dNTP's, tre mikroliter af XTAC buffer, og 23 mikroliter vand til et rør. Derefter tilsættes 0,25 mikroliter af en enkelt gærkoloni til blandingen ved hjælp af en P10 pipettespids og pas på ikke at forstyrre ageren. Efter forstærke DNA ved PCR, køre fem mikroliter af PCR på gelen for at sikre forstærkning er vellykket, passe på ikke at forstyrre celle snavs pellet i bunden af røret.
Repræsentative resultater for CRISPR medieret genomredigering i C.Albicans vises her. C.Albicans blev omdannet med guide RNAs og reparation skabeloner, der er målrettet C.Albicans TPK2. En EcoR1 begrænsning fordøjelse site og stoppe codons i reparation skabelon forstyrre PAM site og lette screening for korrekte mutanter.
Koloni PCR efterfulgt af begrænsning fordøjelse hurtigt adskiller vilde type fra redigerede sekvenser. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at kontrollere for flere kopier af vejledningen RNAs klonet i PV1524. Da dette vil sænke genom redigering effektivitet.
Glem ikke, C.Albicans er en BL2 patogen, og altid hvor det er relevant lab påklædning og følge alle sikkerhedsprocedurer, mens du udfører denne procedure.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
