胚胎小鼠神经干细胞的分离与培养

该视频协议的目的是建立胚胎小鼠神经干细胞分离与培养的来源和有效协议。你好，我是玛丽亚姆·萨德吉-扎德我是罗扬研究所细胞和分子生物学硕士生。

今天，我和我的同事想告诉你如何从13个胚胎小鼠的腺体中收获神经干细胞。你好，我是巴哈雷·阿里扎德-肖尔杰斯坦。我是罗扬生物技术研究所干细胞系细胞和分子生物学硕士生。

你好，我是雷扎·德加尼-瓦南哈斯蒂。我也在罗扬研究所学习细胞和分子生物学。外科手术包括从子宫中采集每13个小鼠胚胎。

用弯曲的针尖从头骨中提取大脑，切切胚胎的字体的前部。微解分离的大脑收获的黑帮显赫。分离神经干细胞培养中收获的组织，获得单细胞悬浮。

最后，在悬浮培养中电镀细胞以产生神经细胞。用70%乙醇喷洒，清洁和消毒腹部皮肤。控制皮肤向上腹部，然后用剪刀切割皮肤和下划线面部，以发现腹腔和子宫角。

用剪刀取出含有胚胎的子宫角，并将其转移到含有25ml冷赫佩斯 MEM 缓冲液的 50 ml 锥形管中。将锥形管放在层流罩下。打开引擎盖下的帽子。

将子宫角从管子中拿出，用足够体积的新鲜 HEPES MEM 缓冲液冲洗三次，以消除碎屑和血液。将子宫组织转移到含有 7 至 10 ml 冷 HEPES MEM 缓冲液的 10 厘米培养皿中。用细剪刀打开子宫角，将胚胎移植到含有7至10毫升冷赫佩斯 MEM 缓冲液的新盘中。

现在把10厘米的胚胎放在解剖显微镜下进行微解剖手术。将注射器针的尖端推在钢刀刀片手柄上，使针尖弯曲。弯曲针尖，直到尖端以 70 到 90 度的角度弯曲。

在解剖显微镜下检查针头的尖端，以查看针头尖端的弯曲。自然胚胎在这方面有横向位置。在不改变其位置的情况下，用细钳将胚胎的脖子和身体，然后将针头的弯曲部分深入胚胎头部的字体前部。

那里会有小出血或血块。当弯曲的部分位于凸起朝前额，然后朝后头部时，表面移动针尖。确保切开皮肤和头骨，不要损伤大脑。

横向用针尖推皮肤以发现大脑。将针头从皮肤的侧侧插入到框架下方，从皮肤的侧侧插入到大脑下方的区域。然后通过推它从解剖的头骨中取出大脑。

在视频中，其中侧和横向部分清晰地显示了黑帮的名流。用护理钳保持大脑稳定，然后用微分体切割每个半球的皮层，以暴露黑帮的显赫。将大脑和解剖的结素在含有神经干细胞培养基的15ml离心管中放置。

重复此过程，直到所有大脑都被微解剖。通过将移液器尖端放在管子底部，将悬浮液上下移液器上下 2 5 次，将组织分解以获得单个细胞悬浮液，切开解剖的结杆边缘。将悬架在 110 g 下离心 5 分钟。

取出上一除以，并在EDTA中1ml0.05%管中重新暂停细胞。在37摄氏度下孵育细胞悬浮液10分钟。然后加入等量的大豆蛋白酶抑制剂，以停止三辛活性。

上下移液细胞悬浮液，确保尝试素已完全灭活。将110 g的悬浮液离心5分钟。取出上清液，在1ml完整的神经干细胞培养中重新增加细胞，并计算细胞数量。

将神经干细胞培养的细胞板入合适的大小组织培养瓶中。将 5 ml 2T25、20 ml 转移到 T75，将 40 ml 转移到 T175 烧瓶。神经球将在3天后在37摄氏度的高温下出现在一个加湿的培养箱中，其二氧化碳为5%。

要吸培养神经球，将带悬浮神经球的介质转移到离心机，以110克的离心机进行5分钟，然后丢弃上一代。在1毫升0.05%的三辛EDTA和孵育在37摄氏度10分钟。然后使用大豆本酪蛋白抑制剂灭活三辛，并轻柔地上下移液神经球，使其成为单细胞。

将110 g的悬浮液离心5分钟。丢弃上一液，在1ml神经干细胞介质中重新暂停细胞。这些细胞为下一步在层压层和全涂层表面进行高级实验的培养或培养做好准备。

通过培养一百万个原发性神经干细胞在七天后，细胞的数量将增加到三到四百万。六至七天后，球体的直径应介于 150 至 200 微米之间，在没有 bFGF 和 EGF 的情况下，可对层压多葡萄氨酸涂层盘进行亚培养，以进行神经元分化。流细胞学测定结果表明，构成神经球的细胞中，近95%为内辛阳性，这是神经干细胞的已知标记。

使用β图布林III和刚体纤维蛋白抗体的测定表明，通过培养神经干细胞在涂层表面约94%显示神经元表型和约5%显示胶质表型。在这段简短的视频中，一种实验室技术，用于从13只小鼠胚胎中快速分离神经干细胞。我希望你在神经干细胞培养中取得成功。