Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
3D skanning teknologien bygge bro microcircuits og Macroscale hjerne profilen inne 3D romanen embedding overlappende protokollen
Chapters
Summary May 12th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne artikkelen introduserer en eksperimentell protokoll ved hjelp av 3D-skanning teknologi som bygger bro over to romlige skalaer: den makroskopisk romlige skalaen av hele hjernen anatomi fotografert av MRI på > 100 μm og mikroskopisk romlig skala av neuronal distribusjoner ved hjelp av immunhistokjemi farging og en multielectrode array system og andre metoder (~ 10 μm).
Transcript
Denne protokollen er den første til å introdusere 3D-skanneteknologi i det anatomiske, spesielt nevroanatomiske forskningsfeltet, og har oppnådd svært nøyaktig overlappende ytelse. 3D-nevroinnbyggingsoverlappingen, eller 3D-nevroprotokollen, bygger inn sterile mikroskalasoktiske kontakter i makroskala hjernebilder, og bygger bro over disse forskjellige romlige skalaene sømløst. Vi må også bruke 3D neuro protokollen til menneskelige MRI og post-mortem hjerne.
Overlappingen gjør det mulig for oss å identifisere kjente MR-kontrastmønstre knyttet til sykdom. 3D-skannesystemer er følsomme for vann rundt den ekstraherte bioorganismen, så det er viktig å tørke vannet veldig nøye. Videre må prosedyren utføres så raskt som mulig.
Begynn denne prosedyren med utarbeidelse av en mus, samt MR-oppkjøp og utstyrspreparater som beskrevet i tekstprotokollen. På dag to, kutt hodebunnen av en tidligere eutanisert mus langs sagittal sutur ved hjelp av kirurgisk saks. Bruk kirurgisk saks for å kutte skallen i diagonale retninger fra lambdapunktet til et punkt litt foran bregma.
Deretter skreller forsiktig av skallen fra hjernen ved hjelp av buede pinsett. Løft hjernen med en slikkepott og overfør den til en petriskål med iskald skjæreløsning. Ved hjelp av en ekstern gassbombe med en kontrollert roterende pumpehastighet, strømmer luft som inneholder 95% oksygen og 5% karbondioksid for å generere små bobler i den iskalde skjæreløsningen.
Etter ett til to minutter, legg hjernen på en mikrofiberklut hvis overflate er litt dekket av en mel sil. Tørk forsiktig av væsken fra hjerneoverflaten ved hjelp av mikrofiberkluten. Sett hjernen, med sitt dorsale aspekt opp, på prøvestativet.
Plasser deretter prøvestativet midt på den automatiske platespilleren. Gjør rommet mørkere under 3D-skanningen og utfør en 3D-skanning på platespilleren. Hvis du vil teste om 3D-skanningen fungerer bra, klikker du på 3D Scan ved å velge vinkelen mellom to bilder som 22,5, startvinkelen som null og den endelige vinkelen som 360.
Flytt hjernen til en petriskål og boble hjernen i skjæreløsningen i ca 10 sekunder. Skjær hjernen i to blokker midt i koronarplanet, ved hjelp av en skalpell. Deretter flytter du de to hjerneblokkene forsiktig til den flate overflaten ved hjelp av en kirurgisk slikkepott.
Fest hjerneblokkene i hjerneblokkbasen ved hjelp av øyeblikkelig lim. Tørk væsken mykt og forsiktig fra hjerneoverflaten innen ett til to minutter, ved hjelp av mikrofiberkluten. Deretter utfører du en 3D-skanning på nytt.
Fest et blad til bladholderen på vibratomen. Fest den svarte tapen som dekker midten av hjerneblokkbasen til midten av skjærestadiet for en vibratom. Hell skjæreoppløsningen i skjæretrinnet og sett skjæretrinnet på vibratomen.
Juster skjærehastigheten og amplituden. Lag to til fem koronale skiver på 300 mikrometer tykke fra de to hjerneblokkene. Hold løsningen i skjærefasen boblende hvis mulig.
Optimaliser skjærehastigheten, frekvensen og vibrasjonsalituden til systemet ved å angi dem som 12,7 millimeter per minutt for hastigheten, 87 til 88 hertz for frekvensen og 0,8 til 1,0 millimeter for svingbredden. Mens du kutter hjerneskiver, registrerer du den skivede koordinaten i formatet, inkludert den fremre-bakre koordinaten, halvkulen og andre forhold. Overfør forsiktig hjerneskivene til et beger fylt med forhåndsoppvarmet ACSF ved hjelp av en tykk plastpipette.
Inkuber hjerneskivene i begeret ved ca. 34 grader Celsius i en time. I løpet av denne tiden, utføre en 3D-skanning av de gjenværende hjerneblokker på kutte scenen. Nå, sett en multielectrode array, eller MEA chip, på en opptaksenhet.
Koble brikken til en peristaltisk pumpe ved hjelp av to rør. Bruk ett rør til å lede samme ACSF inn i MEA-brikken og det andre røret for å lede ACSF ut av MEA-brikken. Fest to nåler, koblet på tuppen av de to rørene, til toppen av veggen av MEA-brikken.
Fest sine posisjoner med sine tips etter den indre veggen av MEA-brikken. Angi strømningshastigheten for ACSF til 4,1 RPM. Utfør MR-databehandling for å trekke ut kortikale volumer som beskrevet i tekstprotokollen.
For å utføre MR-bildebehandling, last ned 3D Slicer gratis programvare. Åpne MR-bildene av de ekstraherte hjernene som ble produsert ved hjelp av volumgjengivelses- og redigeringsmodulene i 3D Slicer. Endre modusen fra redigeringsprogram til volumgjengivelse, og klikk på en målknapp for å få bildet av hjernen til å komme til midten av skjermen.
Velg MRT-2 hjernemodus og tune terskler ved å flytte skiftlinjen. Deretter går du tilbake fra volumgjengivelse til redigeringsprogram og klikker terskeleffektknappen. Påfør etiketten 41, hjernebarken.
Deretter lagrer du hjerneoverflatedataene som en STL-fil ved å endre filformatet fra VTK til STL på skjemasjekklisten. Utfør en automatisk kjernegistrasjon blant åtte eller 16 bilder tatt fra åtte eller 16 forskjellige vinkler i en sekvens av en skanning for å korrigere små uoverensstemmelser. Hvis du vil gjøre dette, klikker du Global registrering inkludert i justeringsalternativet og integrerer bildene.
Gjenta skanninger fra forskjellige vinkler for å oppnå hele hjerneoverflaten. Hvis integreringen mellom bilder som ble skannet fra forskjellige vinkler ikke var vellykket, klikker du Manuell justering og velger et par faste bilder og et bevegelig bilde. Start den manuelle justeringen av bildene ved å velge tre eller fire vanlige punkter i forskjellige bilder.
Klikk deretter OK. Optimaliseringsalgoritmen er den iterative nærmeste punktalgoritmen og inkluderer ikke en ikke-lineær deformasjon. Lag et nett av alle de justerte bildene ved å velge alle bildene og klikke på mesh generasjon-knappen. Velg deretter alternativet, et lite kunstnerisk objekt, for å få nettet med høyest oppløsning.
Lagre bildet som STL Binært eller et ASCII-format. Nå åpner du MR-overflaten og slår den sammen med 3D-skanneoverflaten ved hjelp av overflatebehandlingsprogramvaren. Utfør en manuell justeringsprosess som før.
Deretter lagrer du disse medregistrerte overflatebildene på nytt. Rengjør om nødvendig de enkelte overflatedataene ved å slette små lyder rundt hjerneområdet, spesielt når det gjelder MR-data, og ved å fylle hull, spesielt når det gjelder 3D-skannedata. Til slutt åpner du overflatedataene med dataanalyseprogramvare som MATLAB.
Generer og evaluer histogrammene for minimumsavstandene mellom de to overflatene. Avstander ble evaluert mellom kortikale overflater produsert ved å strippe MR-volum og overflater hentet fra 3D-skanninger av ekstraherte hjerner. Modusverdiene for histogrammet av avstandene er bare 55 mikrometer.
I tillegg, når du samler histogrammet fra det punktet hvor avstanden er lik null, når den akkumulerte verdien 90% av totale utvalgstall på ca. 300 mikron. Det siste histogrammet av avstandene mellom to overflater viste en typisk topp rundt 50 mikrometer. Fra et makroskopisk synspunkt tilsvarer denne modusverdien den geometriske begrensningen, som var 100 mikron fra voxelstørrelsen på MRI-er.
Dette punktet antyder indirekte at den overlappende algoritmen mellom MR og 3D-skanning fungerte utmerket bra, og at støynivåene til både MR og 3D-skanningen ble undertrykt som en lav verdi. Denne protokollen er den første til å oppstår gjennom skanneteknologien til bioorganismen. Teknologien ble opprinnelig benyttet for rent tekniske krav.
Bruk av denne teknologien på medisin kan svare på nye spørsmål. Etter 3D-skanning kan vi bruke kalsium-imaging vegg patch gram opptak for å få komplementær kunnskap i form av temporal og spacial oppløsning og registrerte antall celler. Den svært nøyaktige overlappende ytelsen denne protokollen gir, vil gjøre en sømløs sammenheng mellom den anatomiske romlige skalaen og den null-romlige skalaen mer realistisk enn før.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
