Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En metode for 3D rekonstruksjon og Virtual Reality analyse av gliacellene og neuronal Cells
Chapters
Summary September 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Den beskrevne rørledningen er utformet for segmentering av elektron mikroskopi datasett som er større enn gigabyte, for å trekke ut hele celle morfologier. Når cellene er rekonstruert i 3D, tilpasset programvare designet rundt individuelle behov kan brukes til å utføre en kvalitativ og kvantitativ analyse direkte i 3D, også ved hjelp av virtuell virkelighet å overvinne vise okklusjon.
Transcript
Den automatiserte seriell seksjon elektron mikroskopi teknikker. Hastighetsbegrensende trinn i rørledningen som fører til generering av biologiske tredimensjonale modeller bildebehandling. Vår protokoll gir en trinnvis retningslinje for å produsere en tyngre konstruksjon av bildevolumer på bare noen få dager.
Kombinert med en tilnærming til kvantitative målinger ved hjelp av tredimensjonale modeller. Med denne teknikken kan 3D-strukturen av vev, annet enn hjernen, potensielt analyseres for å identifisere strukturelle funksjonsnedsettering som er typiske for visse sykdommer og for å forbedre diagnostisk strategi. Segmentering er et kjedelig skritt.
Ta deg tid til å gjøre det så nøyaktig som mulig for å unngå korrekturlesing av en dårlig segmentering og måtte starte hele prosessen på nytt. Utformingen av programvaren noen ganger ikke veldig brukervennlig. Derfor er det viktig å se startarbeidet med segmenteringen.
Åpne bildestakken ved å dra og slippe den opprinnelige filen fra mikroskopet som inneholder bunken, eller kjøp dra og slippe mappen som inneholder hele bildestakken inn i programvarevinduet Når stakken er åpnet, gå til bilde, egenskaper, for å sikre at voxels-størrelsen er lest fra metadataene. Forvandle bildet til 8-biters ved å klikke på bilde, skriv inn og velg 8-biters. Hvis den opprinnelige bunken er anskaffet som forskjellige fliser, påfør søm i TrakEM2.
Opprett et nytt TrakEM2-prosjekt ved hjelp av Ny, TrakEM2 Bruke TrakEM2 innebygde funksjoner segmentstrukturer av interesse ved behov. I TrakEM2's gooey høyreklikker du'på noe'under malvinduet, og velg legg til ny underordnet områdeliste'Dra og slipp alt'i mappen, under prosjektobjekter', og en noe'ville vises der. Dra og slipp, områdelisten'fra malen til alt som er plassert under prosjektobjektene'På bildestakkvisningsporten velger du Z-space'med markøren.
Områdelisten vises med det unike ID-nummeret. Velg penselverktøyet øverst, og bruk musen til å segmentere en struktur ved å fylle cytosolen over hele Z-stakken. Eksporter segmentert masse, som skal brukes i Ilastik som frø for carving.
Hvis du vil gjøre dette, høyreklikker du enten på områdelisteobjektet på Z-plass-listen eller på masken i visningsporten, og velger export'area list'som etiketter T-I-F. Avhengig av oppløsningen som trengs for ytterligere rekonstruksjoner, kan du redusere pikselstørrelsen på bildestakken ved å prøve ned. Vurder minnekravene til programvaren som skal brukes til segmentering og rekonstruksjon.
Ilastik håndterer stabler på opptil fem hundre piksler på X-Y. Ta hensyn til, minimumsstørrelsen som objektene fortsatt ser gjenkjennelig og dermed kan segmenteres. Bruk bilde'juster størrelse'For å forbedre kontrasten og hjelpe segmenteringen, kan det uskarpe maskefilteret brukes for å gjøre membranene skarpere.
Bruk process'filters'unsharp mass'Export the image stack as single images'for videre behandling i segmenteringsprogramvare, ved hjelp av file'save as'image sequence'og velg TIFF'format. I hoved-Ilastik gooey velger du carving'modulen. Last inn bildestakken, ved hjelp av legg til nye'og legg til et enkelt 3D / 4D-volum fra sekvens'Velg hele katalogen'og velg mappen som inneholder bildestakken lagret som enkeltfiler'Nederst i det nye vinduet, hvor alternativer for lasting av bildene er til stede, sørg for å holde Z"valgt.
For følgende trinn finner du alle operasjoner og knapper på venstre side av hovedprogramvaren gooey. Bruk standardalternativene som allerede er merket under kategorien forhåndsbehandling. Bruk rike linjers filtre og hold filterskalaen på 1.600.
Denne omkretsen kan endres etterpå. Når forhåndsbehandlingen er fullført, velger du neste side i rullegardinmenyen i merkemodulen. Ett objekt og én bakgrunn finnes som standard.
Velg objektfrøet ved å klikke på det og tegne en linje på toppen av strukturen av interesse. Deretter velger du bakgrunnsfrøet og tegner én eller flere linjer utenfor objektet som skal rekonstrueres. Nå klikker du på segmentet'og venter.
Avhengig av kraften i datamaskinen, og størrelsen på stabelen, kan segmentering ta fra noen få sekunder til timer. Når den er ferdig, skal en halvgjennomsiktig maske som fremhever segmenteringen, vises på toppen av den segmenterte strukturen. Bla gjennom stakken for å kontrollere segmenteringen.
Segmenteringen, kan ikke være nøyaktig hvis den ikke følger strukturen av interesse eller søl ut fra den. Korriger eventuelle søl over ved å plassere et bakgrunnsfrø på sølt segmentering. Og legg til et objektfrø over det ikke-rekonstruerte segmentet av gjenstanden av interesse.
Nøyaktig visuell korrekturlesing av segmenteringen med Ilastik kan være kjedelig, men det er viktig å sørge for at de eksporterte objektene ikke inneholder artefakter. Hvis segmenteringen fortsatt ikke er riktig, kan du prøve å endre med bias-parameteren som vil øke eller redusere mengden usikre klassifiserte piksler som godtas. Verdien er 0,95 som standard.
Reduser den for å begrense eventuelle oversvømmelser eller øke hvis segmenteringen er for konservativ. En annen mulighet er å klikke på forhåndsbehandling'og å endre størrelsen på filteret. Å øke verdien vil minimere salt- og pepperstøylignende effekter, men vil også gjøre membranene mer uskarpe og mindre detaljer vanskeligere å oppdage.
Dette kan begrense søl. Gjenta så mye som nødvendig så lenge alle ønskede objekter har blitt segmentert. Når et objekt er ferdig, navigerer du til segmentet og klikker på lagre gjeldende objekt'To nye frø ser ut til å starte segmenteringen av et nytt objekt.
Abstrakt overflate måler med en gang som O-B-J filer ved å klikke på eksport alle meshes'Å visualisere manuelt segmenterte modeller i 3D i TrakEM2, høyreklikk områdeliste, og velg deretter vis i 3D'A høyere verdi vil generere en lavere oppløsning mesh. Til slutt eksporterer du 3D-nettet som WaveFront O-B-J'ved å velge fra menyfilen'eksportoverflater'WaveFront'Etter å ha installert neuro morph verktøysettet som beskrevet i tekstprotokollen, åpne blender. Importer objektene ved hjelp av den satsvise importen av nevromorf ved å klikke importobjekter under scenemenyen for å importere flere objekter samtidig.
Pass på å aktivere, bruk re-mesh og glatt skyggelegging. Velg objektet av interesse fra out-liner og endre Octree Dybde av re-mesh-funksjonen under spesialmenyen. Arbeid iterativt for å minimere antall toppunkt og for å unngå å miste detaljer i oppløsning og riktig morfologi.
Når du endrer Octree Depth, vil nettet på hovedgatene endres tilsvarende. Når du er ferdig, klikk på gjelder for å fullføre prosessen. Naviger til neuro morph menyen på venstre panel og bruke bildet superimposition verktøy bilde stabel interaksjoner for å laste bildestakken.
Pass på å angi den fysiske størrelsen på bildestakken for X, Y og Z og velg banen til stakken ved å klikke på kilde Z.X og Y er ortogonale plan. De er valgfrie og lastes bare inn hvis brukeren setter inn den gyldige banen. Velg deretter et nett på visningsporten ved å høyreklikke på den.
Gå inn i redigeringsmodus ved å trykke på fanen, velg ett eller flere toppunkt ved hjelp av muse høyreklikk og til slutt klikker du på vis bilde på toppunktet. Ett eller flere kuttede fly med mikrografen vil vises lagt over nettet. Velg det kuttede flyet ved å høyreklikke på den.
Trykk deretter på kontroll Y og bla over 3D-modellen ved hjelp av muserulle. Dette kan også brukes som korrekturlesingsmetode. Vist her er segmentering og rekonstruksjon ved hjelp av TrakEM2 og Ilastik.
TrakEM2 gooey vises med objekter manuelt segmentert i rødt. Den eksporterte masken kan deretter brukes som inndata for halvautomatisk segmentering. Fra Ilastik kan masker videre eksporteres til TrakEM2 for manuell korrekturlesing.
Masker kan eksporteres som 3D trekantede masker for å avsløre rekonstruerte strukturer. I dette eksemplet ble fire nevroner, astrocytter, microglia og pericytes rekonstruert ved hjelp av denne prosessen. En 3D-analyse av rekonstruerte morfologier ved hjelp av tilpassede verktøy vises.
Her er et isotropisk bildevolum fra et fokusert iionstråleskanningsdatasett for elektronmikroskopi. En tett rekonstruksjon av disse dataene avslører aksoner, den astrocytiske prosessen og dendrittene. Denne mikrografen viser eksempler på mål for kvantifiseringer som synapser og astrocytisk glykogengranulat.
Masken fra den mikrografen viser fordelingen av glykogengranulat rundt synapser. Vist her er en grafisk illustrasjon av inndata og utgang av grafisk visualisering av glykogen-avledet laktat absorpsjon modell eller GLAM'Her, en bruker er vist iført en virtuell virkelighet eller V-R headset mens du arbeider med tett rekonstruksjon fra en fokusert ion stråle skanning elektron mikroskopi datasett. Fra en undergruppe av neuritter kan en oppslukende V-R-scene observeres.
Den grønne laseren peker på en GLAM'peak. er av primær betydning som den bestemmer riktig størrelse på de eksporterte 3D-objektene og bestemmer sine målinger gjenspeiler den faktiske størrelsen. Konseptet med seriel seksjon bildebehandling, bildesegmentering og 3D konstruksjon er ganske gammel.
Å oppdage den tekniske akselerasjonen fører til fremskritt i kolektomier i gjennomgang av anatomilærebøkene. Selv om metoden ble utviklet for hjerneforskning i elektronmikroskopi, kan den generaliseres til hvilken som helst og mikroskopiteknikk som genererer data Videre kan enhver form for 3D-bildeteknikk dra nytte av slike bildesegmenterings- og konstruksjonsteknikker. Inkludert C-T-skanninger og M-R-I.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
