Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En musemodel at vurdere medfødte immunrespons for Staphylococcus aureus infektioner
Summary February 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
En tilgang er beskrevet til real-time opdagelse af medfødte immun respons til kutane såret og Staphylococcus aureus infektion af mus. Ved at sammenligne LysM-EGFP mus (som besidder fluorescerende neutrofiler) med en LysM-EGFP krydset immundefekte mus stamme, vi fremme vores forståelse af infektion og udvikling af metoder til at bekæmpe infektion.
Transcript
Teknikker, der overvåger bakterier byrde og en neutrofisk reagere samtidigt kan give indsigt i mekanismerne i Staph aureus persistens og effekten af behandlingsstrategier. Den største fordel ved denne teknik er, at flere parametre kan måles i længderetningen i en levende vært i hele infektionens varighed. Det er afgørende at vise, hvor at placere såret på en mus dorsum, hvordan punktafgifter huden, og hvordan man kan vaccinere såret med Staph aureus.
Begynd med optøning af bioluminescens Staph aureus stamme af interesse fra negative 80 grader Celsius opbevaring på is. Før striber kulturen på en 5% kvæg blod agar plade. For en overnatning inkubation på 37 grader Celsius.
Den næste morgen, overføre tre til fire individuelle kolonier fra Staph aureus plade i tryptiske soy bouillon, eller TSB. Suppleret med 10 mikrogram pr. milliliter chloramphenicol for en natskrystende inkubation ved 37 grader Celsius. Næste morgen fortyndes 120 mikroliter af kulturprøven i seks milliliter TSB.
Med 10 mikrogram pr. milliliter chloramphenicol, for en to timers inkubation ved 37 grader Celsius, og 200 rotationer i minuttet. Når den optiske massen ved 600 nanometer når 0,5, overføres tre milliliter bakteriesuspension til 10 milliliter iskold DPBS. Efter omhyggeligt dekantering af supernatant, tilsæt yderligere kølet DPBS til pellet, og vortex de re-suspenderet bakterier grundigt.
Efter en anden centrifugering suspenderes bakteriepellet igen i 1,5 milliliter PBS på is. For at kontrollere bakteriekoncentrationen fortyndes 100 mikroliter af bakteriesuspensionen med en faktor på 1 x 10 til 4. Og plade 20 mikroliter af hver fortynding på individuelle agar plader.
Efter en overnight inkubation ved 37 grader Celsius, tælle antallet af kolonidannende enheder ved bruttoundersøgelse for at beregne bakteriekoncentrationen fra den foregående dag. For excisional hud sår af modtageren dyr, bekræfte en manglende reaktion på tå knivspids, før barbering en en af to tommer sektion på bagsiden af musen. Tør forsigtigt for at fjerne eventuelle herreløse hår.
Og desinficere den eksponerede hud, med sekventiel 10% povidone jod, og 70% ethanol gennemblødt gaze applikationer. Bevæger sig udad fra midten af det kirurgiske område, i en spiral mønster. Efter at lade huden tørre i ca. et minut, skal du trykke hårdt på en steril seks millimeter punch biopsi i midten af det forberedte kirurgiske område.
Twist punch biopsi at skabe en cirkulær skitse på huden, der fuldt ud skærer gennem hudvæv, og mindst én del af omridset. Pas på ikke at skære i den underliggende fascia eller væv. Brug derefter steril saks, og fortræt, at skære gennem epidermis og dermis, efter det cirkulære mønster præget af punch biopsi.
Ved Staph aureus-inokulering fyldes en 28 gauge insulinsprøjte med 50 mikroliter af det forberedte bioluminescerende bakterielle inokuleringsmiddel. Og brug en finger til at trække dermis af de sårede dyr til siden. Hold sprøjten næsten parallelt med vævet, langsomt indsætte sprøjten i vævet, indtil et pludseligt fald i modstanden mærkes.
Angiver piercing af fascia. Med nålen placeret i midten af såret, langsomt levere hele volumen af inoculant. Bekræft, at inokuleringsmidlet danner en boble i midten af såret med minimal lækage eller spredning.
Og fjern sprøjten langsomt fra dyret. Derefter returnere dyret til det bur med varme og overvågning, indtil fuld helbredelse. Efter sårede og infektion, og dagligt under forsøget, placere bedøvet musen i en bioluminescerende og florescence imager, med såret så fladt som muligt.
I imager-softwaren skal du vælge luminescens og fotografere som billedtilstande. Eksponeringstiden skal indstilles til et minut ved lille binning, F/Stop 1 for luminescens, F/Stop 8 for fotografi og åbne for emissionsfilteret. Klik derefter på hentning for at optage billedet.
For in vivo fluorescens imaging, skal du vælge fluorescens, og fotografi, som billeddannelse tilstande. Eksponeringstiden skal indstilles til et sekund ved lille binning, F/Stop 1 for fluorescens, F/Stop 8 for fotografi, og Excitation og Emission bølgelængder på 465 over 30 nanometer, og 520 over 20 nanometer, med en høj lampe intensitet, henholdsvis. Klik derefter på hentning for at optage billedet.
Efter at have fået begge sæt af billeder, returnere dyret til det bur, med overvågning, indtil fuld helbredelse. Til billedanalyse skal du åbne det billede, der skal kvantificeres, i et passende billedanalysesoftwareprogram og placere det cirkulære standardområde for interesse over hele sårområdet, herunder den omgivende hud. Klik måle region af interesse, og registrere værdierne for den gennemsnitlige flux for såret, at tillade den gennemsnitlige flux af hvert signal, der skal afbildes versus tid.
For at måle sårheling, passer en cirkulær region af interesse over såret kant, og måle arealet af såret i centimeter kvadreret, at tillade plotte af fraktioneret ændring fra baseline versus tid. I dette repræsentative eksperiment viste betinget EGFP-udtryk myeloid differentierings primære respons 88, Eller MyD88 knockout mus, en større følsomhed over for Staph aureus-inokulering, end ikke-betinget EGFP, der udtrykte dyr. Med en 80% dødelighed observeret i løbet af de første otte dage af infektion.
Begge stammer af mus mistet ca 5% af deres kropsvægt umiddelbart efter infektion. Men den betingede EGFP, der udtrykte mus, genvundet deres oprindelige vægte efter dag to. Mens MyD88 mus ikke.
Sårlukning i nærvær af Staph aureus infektion var ikke anderledes mellem de to stammer. Men sterilt sårede MyD88 knockout mus, havde en betydelig defekt i sårheling, sammenlignet med betinget EGFP udtrykke dyr. Hele dyr billeddannelse afslørede en højere bakteriel byrde, som det fremgår af en øget bioluminescerende signal i sårene af MyD88 knockout dyr, sammenlignet med betinget EGFP udtrykke dyr.
En 40% fald i indledende neutrofil handel med ikke-inficerede sår af MyD88 knockout dyr, blev også observeret i forhold til betinget EGFP udtrykke dyr. koloniformningsenheder af Staph aureus blev indført umiddelbart efter såret, blev neutrofil handel signifikant svækket i knockout-dyr sammenlignet med betinget EGFP, der udtrykte dyr. Før bakterierne dispenseres, skal du sørge for, at der ikke er luftbobler i sprøjten, og at placeringen af nålen er korrekt placeret i midten af såret.
Animalsk væv kan høstes i slutningen punkt til at måle udtryk for proteiner af interesse og bakteriel formidling fra såret. Staph aureus smitter af på mennesker. Som sådan bør personlige værnemidler bæres ved håndtering af bakterier, og forsigtighed bør udvises, når håndtering af en sprøjte, der indeholder patogenet.
Denne teknik har hjulpet udforske brugen af biologiske behandlinger for Staph aureus infektioner, der forbedrer værter medfødte immunrespons mod infektion.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE