52,807 Views
•
08:46 min
•
November 12, 2019
DOI:
xCELLigence cellanalyse i realtid giver dig mulighed for kvantitativt at overvåge aflivning af kræftceller af immunceller under etiketfrie forhold og i løbet af flere dage. Dette system giver et komplet tidsforløb af målkræft celle drab tillader samtidig screening af et stort antal konstruktioner, effektor celletyper, eller kombinationsbehandlinger ved lav effektor til målforhold. Begynd med at så 1,5 gange 10 til de syv HEK293FT celler i DMEM kultur medium i en 150 milliliter cellekultur fad til en overnatning inkubation ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid med fugtighed.
Næste morgen blandes 2,5 milliliter transfektionfortyndingsopløsning suppleret med fem mikrogram lentiviral vektorplasmid-DNA og 22,5 mikrogram lentiviral emballageblanding med 82,5 mikroliter transfektionsreage hos 2,5 milliliter transfektionfortyndingsopløsning. Efter en 15 minutters inkubation ved stuetemperatur, overføre reaktionsfaldet klogt ind i skålen af HEK293FT celler og returnere cellerne til inkubatoren i en anden natten inkubation. Den næste morgen, erstatte supernatant med 19 milliliter frisk DMEM kultur medium og returnere cellerne til kuvøse natten over.
Supernatanten opsamls i et enkelt 50 milliliter konisk rør i fire grader Celsius-opbevaring i de næste to dage, før den udvisker lentivirus ved centrifugering den anden morgen for at fjerne celler eller snavs fra opløsningen. Overfør alle, men omkring en milliliter af lentivirus indeholdende supernatant til en ultra klar centrifuge rør til ultracentrifugering. Efter ultracentrifugering, omhyggeligt aspirere den resterende virus, der indeholder supernatant, forsigtigt tilføje 100 mikroliter DMEM til pellet, og placere røret på is i 15 minutter.
Ved inkubationens afslutning blandes opløsningen forsigtigt, og lentivirusopløsningen anbringes i forkølede sterile rør til opbevaring ved minus 80 grader Celsius. Derefter bestemme titer af lentivirus ved kvantitativ RT-PCR i henhold til producentens anvisninger. Til generering og ekspansion af CAR-T-celler aktiveres en til to gange 10 til de seks perifere mononukleare celler i en milliliter CAR-T-cellemedium med et tilsvarende antal CD3/CD28-belagte mikroperler i en brønd af en 24-brøndplade i cellekulturkubvøsen i 24 timer.
De følgende to morgener blandes en mikroliter af transduktionsforstærker med cellerne efterfulgt af tilsætning af lentivirus ved en mangfoldighed af infektion på fem til en. T-cellevæksten overvåges hver anden til tredje dag og tilsættes frisk CAR-T-cellemedium efter behov for at holde cellerne på en en til to gange 10 til de seks celler pr. milliliterkoncentration. For at detektere T-celle CAR-ekspression ved flowcytometri overføres tre gange 10 til de femte CAR- og ikke-transucerede T-celler til individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.
Cellerne opsamls ved centrifugering og opstimer pellets i 200 mikroliter FACS-buffer suppleret med 1% humant serum. Opdel hver celleprøve i 100 mikroliter aliquots i individuelle fem milliliter polystyren FACS rør på is. Efter fem minutter tilsættes en mikroliter biotinyleret FAB2-fragmenter af ged-antimusen FAB2 til et rør af hver celletype og to mikroliter PE-mærket anti-tag antistof til det andet rør af hver celletype med grundig blanding.
Efter 30 minutter på is vaskes cellerne med tre milliliter frisk FACS-buffer og efter centrifugering dekantere supernatanterne. Opslæm pellets i de resterende supernatant og tilsæt to mikroliter af APC anti-CD3 og to mikroliter af 7-AAD til hvert rør. Tilsæt en mikroliter AF PE-mærket Streptavidin med kort blanding til røret plettet med anti-FAB2 antistof og inkubere alle rørene på is i 30 minutter.
Ved slutningen af inkubationen analyseres cellerne ved flowcytometri i henhold til standardprotokoller, der gatinger T-cellerne ved fremadspistning versus side scatter og CD3 versus 7-AAD udtryk. For en real-time cytolyse potens assay, tilføje 50 til 100 mikroliter af målcellekultur medium til hver brønd af en e-plade og måle baggrunden impedans i en celle analysator instrument. Detekter målkræftcellerne fra kulturpladen ved hjælp af trypsin.
Vask cellerne i 15 milliliter frisk kulturmedium og centrifuge. Resuspend kræftcelle pellet i fem milliliter frisk medium til optælling og justere celletætheden til den relevante målcellekoncentration. Tilsæt cellerne til det passende antal brønde og lad e-pladen i 30 minutter ved stuetemperatur, så cellerne kan sætte sig jævnt på bunden af brøndene.
Ved afslutningen af ækvilibreringsperioden skal pladen i realtidscelleanalysatoren og automatisk påbegynde målingen af impedansen hver 15. Vedhæftning og spredning af målcellerne kan spores i realtid. Næste morgen fortyndes effektoren CAR og kontroller T-cellerne til den rette koncentration i de enkelte rør, og 50 til 100 mikroliter fjernes fra hver brønd af e-pladen, så det endelige volumen i hver brønd er 100 mikroliter.
Dernæst frø effektoren og kontrol T-celler i de relevante brønde på passende effektor til mål nøgletal i 100 mikroliter af medium pr brønd. Derefter jævnbyrde e-pladen i 30 minutter ved stuetemperatur, før du returnerer pladen til celleanalysatorsystemet. For at måle effekten af T-cellen medieret drab af målet kræftceller, overvåge CAR-T medieret drab i 96 timer.
Omkring 50% af CAR-T-cellerne forblev positive for anti-single kæde variabel fragment antistof, der angiver udtrykket af CAR i omkring 50% af T-cellerne. I dette repræsentative eksperiment blev der anvendt en 10-1 effekt eller mål-forholdet for alle grupperne. Kun Raji-celler og CD22-CAR T-cellebehandlede Raji-celler viste signifikant drab sammenlignet med kun kontrol-T-cellen og Mock CAR-T-cellegrupper.
I dette eksperiment, kun CD47-CAR-T celler var effektive til at dræbe kræft i bugspytkirtlen celler. Desuden var impedanssignalet fra CD47-CAR-T-cellerne alene kun lidt over celleindekssignalet målt i mediet alene brønde, hvilket indikerer, at impedanssignalet fra suspensionsceller som CAR-T-celler er minimalt og ikke bidrager til det samlede impedanssignal, når CAR-T-celler føjes til målkræftcellerne. Især blev GITR-co-stimulatorisk domæne observeret for at være mere effektivt til at forbedre CAR-T-celledrab mod epitelvækstfaktorreceptor positive målceller sammenlignet med originale CAR-konstruktioner uden GITR-domænet.
Mediet fra e-pladeblyde kan indsamles for at analysere cytokinprofilen på tidspunkter enten under eller efter analysen i henhold til eksperimentets behov. Samlet set har xCELLigence forbedret effektiviteten af evalueringen af styrken af forskellige immunterapier lige fra bispecifikke T-celleprotektorer og onkolytiske vira til immunkontrolpunktshæmmere i kombinationsbehandlinger.
Vi beskriver en kvantitativ Real-Time in vitro cytolyse assay system til at evaluere styrken af chimerisk antigen receptor T celler rettet mod flydende og solide tumorceller. Denne protokol kan udvides til at vurdere andre immun Effector celler, samt Kombinationsbehandlinger.
Read Article
Cite this Article
Xi, B., Berahovich, R., Zhou, H., Xu, S., Wei, Y., Guan, J., Harto, H., Guan, J., Wu, L., Santa Ana, D., Cerignoil, F., Lamarche, B., Abassi, Y. A., Golubovskaya, V. A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells. J. Vis. Exp. (153), e59033, doi:10.3791/59033 (2019).
Copy