En potens-analys i real tid för chimeric antigen receptor T-celler riktade mot solida och hematologiska cancer celler

xCELLigence realtid cellanalys gör det möjligt för dig att kvantitativt övervaka dödandet av cancerceller av immunceller under etikettfria förhållanden och under loppet av flera dagar. Detta system ger en fullständig tidskurs av mål cancer cell dödande möjliggör samtidig screening av ett stort antal konstruktioner, effektor celltyper, eller kombinationsbehandlingar vid låg effektor till mål nyckeltal. Börja med sådd 1,5 gånger 10 till de sju HEK293FT cellerna i DMEM odlingsmedium i en 150 milliliter cellodling skålen för en övernattning inkubation vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid med luftfuktighet.

Nästa morgon, blanda 2,5 milliliter transfection utspädningslösning kompletteras med fem mikrogram lentiviral vektor plasmid DNA och 22,5 mikrogram lentiviral förpackning blanda med 82,5 mikroliter transfection reagens i 2,5 milliliter transfection utspädningslösning. Efter en 15 minuters inkubation vid rumstemperatur, överför reaktionsdroppvis i skålen av HEK293FT celler och returnera cellerna till inkubatorn för en andra övernattning inkubation. Nästa morgon, ersätta supernatant med 19 milliliter av färska DMEM kultur medium och returnera cellerna till inkubatorn över natten.

Samla supernatanten i ett enda koniriskt rör på 50 milliliter i fyra grader Celsius lagring under de kommande två dagarna innan du sedimenterar lentiviruset genom centrifugeringen den andra morgonen för att avlägsna celler eller skräp från lösningen. Överför alla men ungefär en milliliter av lentivirus som innehåller supernatant till ett ultra klart centrifugrör för ultracentrifugering. Efter ultracentrifugeringen, aspirera försiktigt det restvirus som innehåller supernatant, tillsätt försiktigt 100 mikroliter DMEM till pelleten, och placera röret på is i 15 minuter.

Vid slutet av inkubationen, blanda lösningen försiktigt och alikvotera lentiviruslösningen i förkylda sterila rör för förvaring vid minus 80 grader Celsius. Sedan bestämma titer av lentivirus genom kvantitativa RT-PCR enligt tillverkarens instruktioner. För CAR-T cell generation och expansion, aktivera en till två gånger 10 till de sex perifert blod mononukleära celler i en milliliter av CAR-T cell medium med lika många CD3/CD28 belagda mikropärlor i en brunn av en 24-brunnsplatta i cellkulturen inkubatorn i 24 timmar.

Följande två morgnar, blanda en microliter av transduktionsförstärkare agent med cellerna följt av tillägg av lentivirus vid en multiplicity av infektion av fem till en. Övervaka T-celltillväxten varannan till var tredje dag och tillsätt nytt CAR-T-cellmedium vid behov för att bibehålla cellerna vid en till två gånger 10 till de sex cellerna per milliliterkoncentration. För att upptäcka T cell CAR uttryck genom flöde cytometri, överföra tre gånger 10 till den femte CAR och icke-transduced T-celler till enskilda 1,5 milliliter microcentrifug rör.

Samla cellerna genom centrifugeringen och resuspend pellets i 200 mikroliter av FACS buffert kompletteras med 1%humant serum. Dela upp varje cellprov i 100 alikvoter i 100 milliliter polystyren-FACS-rör på is. Efter fem minuter, lägg till en mikroliter av biotinylerade FAB2-fragment av get anti-mouse FAB2 till ett rör av varje celltyp och två mikroliter av PE-märkt anti-tag antiantia till det andra röret av varje celltyp med grundlig blandning.

Efter 30 minuter på is, tvätta cellerna med tre milliliter färsk FACS buffert och efter centrifugering dekant supernatanterna. Resuspend pelletsen i resterande supernatant och tillsätt två mikroliter av APC anti-CD3 och två mikroliter av 7-AAD till varje rör. Tillsätt en mikroliter pe-märkt Streptavidin med kort blandning till röret färgas med anti-FAB2 antikropp och inkubera alla rör på is i 30 minuter.

I slutet av inkubationen, analysera cellerna genom flödescytometri enligt standardprotokoll som gating T-cellerna genom framåt scatter kontra sida scatter och CD3 kontra 7-AAD uttryck. För en realtid cytolys potens assay, tillsätt 50 till 100 mikroliter av mål cell kultur medium till varje brunn av en e-platta och mäta bakgrunden impedans i en cell analysator instrument. Upptäcka målet cancerceller från odlingsplattan med hjälp av trypsin.

Tvätta cellerna i 15 milliliter av färskt odlingsmedium och centrifug. Resuspend cancercell pelleten i fem milliliter färskt medium för räkning och justera celltätheten till lämplig målcellkoncentration. Tillsätt cellerna till lämpligt antal brunnar och låt e-plattan i 30 minuter vid rumstemperatur så att cellerna kan bosätta sig jämnt på brunnarnas botten.

Vid slutet av jämviktsperioden, placera plattan i realtid cellanalysator och initiera mätning av impedansen automatiskt var 15 minuter över natten. Vidhäftning och spridning av målcellerna kan spåras i realtid. Nästa morgon, späd effektor CAR och kontrollera T-celler till lämplig koncentration i enskilda rör och ta bort 50 till 100 mikroliter från varje brunn av e-plattan så att den slutliga volymen i varje brunn är 100 mikroliter.

Därefter utsäde effektor och kontroll T-celler i lämpliga brunnar vid lämplig effektor till mål nyckeltal i 100 mikroliter medium per brunn. Sedan jämvikt e-platta i 30 minuter vid rumstemperatur innan du returnerar plattan till cellanalysatorn systemet. För att mäta effekten av T-cellen medierad avlivning av målet cancerceller, övervaka CAR-T medierad dödande i 96 timmar.

Omkring 50%av CAR-T-cellerna färgas positivt för anti-single chain variabel fragment antikropp som anger uttryck för CAR i cirka 50%av T-cellerna. I detta representativa experiment användes en 10 till en effektor till mål-förhållande för alla grupper. Raji celler bara och CD22-CAR T-cellen behandlade Raji celler visas betydande dödande jämfört med kontroll T cellen bara och Mock CAR-T cellgrupper.

I detta experiment, endast CD47-CAR-T-celler var effektiva på att döda cancercellerna i bukspottskörteln. Vidare var impedanssignalen från enbart CD47-CAR-T-cellerna endast något över cellindexsignalen som uppmätts i de medeliga brunnarna som indikerar att impedanssignalen till följd av suspensionsceller som CAR-T-celler är minimal och inte bidrar till den totala impedanssignalen när CAR-T-celler tillsätts till målcancercellerna. Noterbart var ATT GITR co-stimulatory domän observerades för att vara mer effektiva i att förbättra CAR-T cell dödande mot epitelial tillväxtfaktor receptor positiva målceller jämfört med ursprungliga CAR konstruktioner utan GITR domän.

Mediet från e-platta brunnar kan samlas in för att analysera cytokin profilen vid tidpunkter antingen under eller efter analysen enligt behoven av experimentet. Sammantaget har xCELLigence förbättrat effektiviteten för att utvärdera styrkan hos olika immunterapier som sträcker sig från bispecifika T-cell engagers och onkolytiska virus till immunkontrollpunktshämmare i kombinationsbehandlingar.