Immunology and Infection
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用于嵌合抗原受体 T 细胞的实时效力测定，用于定位固体和血液癌细胞
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Summary November 12th, 2019
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我们描述了一个定量实时体外细胞解检测系统，以评估嵌合抗原受体T细胞针对液体和固体肿瘤细胞的效力。该协议可以扩展以评估其他免疫效应细胞，以及联合治疗。
Transcript
xCELLigence 实时细胞分析使您能够定量监测免疫细胞在无标签条件下和多天过程中杀死癌细胞的情况。该系统提供目标癌细胞杀死的完整时间过程，允许同时筛选大量的构造，效应器细胞类型，或联合疗法在低效应器与目标比率。首先在150毫升细胞培养皿中播种1.5倍10至7个 HEK293FT 细胞，在37摄氏度和5%的湿度下进行夜间孵育。
第二天早上，混合2.5毫升转染稀释溶液，辅以5微克的扁病毒载体质粒DNA和22.5微克的扁病毒包装与82.5微升转染试剂混合在2.5毫升转染稀释溶液中。在室温下孵育15分钟后，将反应下降的智者转移到 HEK293FT 细胞的培养皿中，将细胞返回到培养箱进行第二次过夜孵化。第二天早上，用19毫升的新鲜DMEM培养基基代替上能，将细胞返回孵化器过夜。
将上流液收集到单个50毫升锥形管中，储存4摄氏度，再在第二天早上通过离心沉淀扁病毒，以清除溶液中的任何细胞或碎屑。将含有全清液的扁病毒的大约一毫升转移到超清离心管中，用于超离心。超离心后，小心吸进含有上经剂的残留病毒，轻轻将100微升DMEM加入颗粒中，并将管子放在冰上15分钟。
在孵育结束时，轻轻混合溶液，将扁病毒溶液混合到预冷无菌管中，在零下80摄氏度下储存。然后根据制造商的说明，通过定量RT-PCR确定扁病毒的滴度。对于 CAR-T 细胞的生成和扩展，在一毫升 CAR-T 细胞培养基中激活 1 到 2 倍至 6 个外周血单核细胞，在细胞培养箱中 24 个 24 井板的一个井中安装等量的 CD3/CD28 涂层微珠，24 小时。
随后两个早晨，将一微升的转导增强剂与细胞混合，然后以五比一的多重感染增加扁病毒。每两到三天监测T细胞生长，必要时加入新鲜的 CAR-T 细胞培养，以保持细胞在每毫升浓度的 1 到 2 倍 10 到 6 个细胞。要通过流式细胞学检测T细胞 CAR表达，将三乘10转移到第五个 CAR 和非转导 T 细胞，将其转移到单独的 1.5 毫升微离心管中。
通过离心收集细胞，并在200微升的FACS缓冲液中重新填充颗粒，并辅以1%的人血清。将每个细胞样品分成100微升等分，在冰面上单独的5毫升聚苯乙烯FACS管中。五分钟后，将山羊抗小鼠FAB2的一微升生物基化FAB2片段添加到每个细胞类型的一个管中，将两个微升的PE标签抗标签抗体添加到每个细胞类型的另一管中，并进行彻底混合。
在冰上30分钟后，用三毫升的新鲜FACS缓冲液清洗细胞，并在离心后将超级钠的分块冲洗。将颗粒重新在剩余的上更重液中重新添加，并在每个管中加入两个 APC 防 CD3 微升和两个 7-AAD 微升。加入一个微升PE标签的Streptavidin，用与抗FAB2抗体混合的管子进行短暂混合，并在冰上孵育所有管子30分钟。
在孵化结束时，根据标准协议通过流式细胞分析细胞，通过正向散射与侧散射和CD3对7-AAD表达式对T细胞进行门控。对于实时细胞解效力测定，在电子板的每个井中加入50至100微升的目标细胞培养基，并在细胞分析仪中测量背景阻抗。使用 trypsin 从培养板检测目标癌细胞。
用15毫升新鲜培养培养剂和离心机清洗细胞。将癌细胞颗粒重新用五毫升新鲜介质进行计数，并调整细胞密度以适当的目标细胞浓度。将细胞添加到适当数量的井中，并在室温下离开电子板 30 分钟，使细胞均匀地沉淀在井底。
在平衡期结束时，将板放在实时细胞分析仪中，并每 15 分钟自动开始测量一次阻抗。可以实时跟踪目标细胞的粘附和增殖。第二天早上，稀释效应器 CAR，控制T细胞在单个管中的适当浓度，并从电子板的每个井中去除50至100微升，使每个井的最终体积为100微升。
接下来，将效应器播种，并在适当的孔中控制T细胞，以适当的效应器与目标比，每孔100微升的介质。然后在室温下平衡电子板 30 分钟，然后将电子板返回细胞分析仪系统。为了测量T细胞中培养杀死目标癌细胞的功效，监测 CAR-T中导杀戮96小时。
约50%的 CAR-T细胞染色阳性抗单链可变片段抗体，表明 CAR在约50%的T细胞中表达。在这个代表性实验中，所有组都使用 10 比 1 的效应器与目标比率。与仅对T细胞和模拟 CAR-T细胞组相比，仅Raji细胞和CD22-CAR T细胞治疗Raji细胞表现出显著的杀戮。
在这个实验中，只有CD47-CAR-T细胞能有效杀死胰腺癌细胞。此外，仅来自CD47-CAR-T细胞的阻抗信号仅略高于仅在介质井中测量的细胞指数信号，表明悬架细胞（如 CAR-T细胞）产生的阻抗信号最小，在将 CAR-T 细胞添加到目标癌细胞时，不会导致整体阻抗信号。值得注意的是，与没有GITR域的原始 CAR 构造相比，GITR 共刺激域在增强 CAR-T 细胞杀杀对上皮生长因子受体阳性目标细胞方面更有效。
可以收集电子板井的介质，根据实验的需要，在测定期间或之后的时间点分析细胞因子轮廓。总体而言，xCELLigence 提高了评估各种免疫疗法效力的效率，从双特异性T细胞接合剂和在线解合病毒到联合疗法中的免疫检查点抑制剂。
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