Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד
Chapters
Summary January 22nd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
. הנה, פרוטוקול מוצג לבצע, culturing בתאי poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized עם fluorogenic מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP)-פפטיד מתכלה. MMP הסלולר ופעילות מטבולית נמדדים ישירות מן התרבויות הידרוג שימוש בקורא microplate סטנדרטיים.
Transcript
תרבות תלת-מימדית מקשה על מדידת תפקוד התאים, תוך שימוש במתקנים ביולוגיים סטנדרטיים. פרוטוקול זה מאפשר מדידה של פעילות תאית וסומטית ללא עיבוד מדגם נוסף, באמצעות חיישן פלואורסצנטי וקורא מיקרופלסטיק סטנדרטי. פרוטוקול זה מאפשר מספר יישומים חדשים, כולל סינון תרופות תפוקה גבוהה.
בנוסף, ניתן להחליף את חיישן הפלואורסצנט עם חיישן אחר כדי למדוד פרוטאזות או תפקודי תאים אחרים. חשוב לתכנן בזהירות את הניסוי מראש, להשלים את כל החישובים להכנת הידרוג'ל, ולהכשיר את כל הציוד והריאגנסים כדי למזער את תאי הזמן בהשעיה. ראשית, הכינו את המדיה עם 1%פחם מופשט סרום שור עוברי, שני mM L-גלוטמין, 10 יחידות לכל mL של פניצילין, ו 10 מיקרוגרם לכל mL של סטרפטומיצין.
אין להשתמש במדיה אדומה פנול, אשר יש יותר הפרעה פלואורסצנטיות. כדי להפוך פקדים חיוביים, להוסיף סוג אנזים קולגנז חיידקי אחד למדיה assay בריכוזים של 10 ו 1000 מיקרוגרם לכל mL. לאחר מכן, להכין את פתרון מבשר הידרוג'ל על ידי הוספת הריאגנס לצינור 1.5 מ"ל.
הקפד מערבולת לאחר תוספת של כל רכיב. לאחר מכן לחלק את הפתרון לצינורות 1.5 מ"ל מרובים עבור תנאים שונים. כדי אנקפסולציה תאים הידרוג'לים, תחילה להכין השעיה תא יחיד על ידי שטיפת צלחת 10 ס"מ של תאי מלנומה A375 עם 10 מ"ל של PBS.
לאחר מכן, להוסיף 0.05%trypsin לצלחת, כדי לנסות תאים. דגירה המנה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, במשך שלוש דקות. לאחר הדגירה, לספור את התאים עם המוציטומטר.
לאחר מכן, צנטריפוגה פתרון התא ב 314 פעמים G במשך שלוש דקות. שאפו את מדיית התרבות, והתאי PBS יתווספו מחדש בערך פי שלושה מהצפיפות הסופית של העוטף. לספור את התאים שוב כדי להבטיח ריכוז תאים מדויק.
לאחר מכן, להוסיף תאים מושעים PBS לכל צינור של פתרון מבשר הידרוג'ל על פי צפיפות הזריעה הנדרשת, ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. עבור תנאים מבוקרים, רק להוסיף PBS ומערבולת. לאחר מכן, פיפטה 10 microliters של פתרון מבשר הידרוג'ל לאמצע כל באר של סטרילי, שחור, עגול תחתית 96 צלחת היטב.
בדיקה ויזואלית של מיקום ההידרוגלים בתוך בארות. ניתן למקם מחדש הידרוג'לים שאינם ממורכזים באמצעות קצה פיפטה לפני פולמריזציה. כדי להפוך את פתרון מבשר הידרוג'ל, לחשוף את הצלחת לאור UV ב 4 מילי וואט לס"מ מרובע, במשך שלוש דקות.
לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של המדיה המוסווה לכל הבארות המכילות תאים אנקפסולציה, ו-150 מיקרוליטרים של תווי האנזים הקולגנאז ל הבארות של פקדים חיוביים. הוסף 150 microliters של חיץ PBS ל בארות החיצוניות של הצלחת כדי להפחית את האידוי במהלך הדגירה. השתמש בקורא מיקרופלאט כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנט של הצלחת בשעה אפס, מיד לאחר אנקפסולציה.
בחר את פרוטוקול הלוח אטום 96 היטב עם 494 ננומטר העירור, ו 521 אורכי גל פליטת ננומטר. לאחר מכן, הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני, במשך 18 שעות. לאחר מכן הוסיפו ריאגנטים של פעילות מטבולית ביחס נפח של 1 עד 10 לנפח ל- well עבור כל התנאים והפקדים.
דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, במשך שש שעות. לבסוף, למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של הצלחת ב 24 שעות, לאחר אנקפסולציה. בחר את פרוטוקול לוחית הבאר אטום 96, עם 494 ננומטר העירור, ו 521 אורכי גל פליטת ננומטר, עבור פעילות MMP.
כדי למדוד את הפעילות המטבולית, בחר 560 ננומטר העירור, ו 590 אורכי גל פליטת ננומטר. במחקר זה, עם חשיפת החיישן הפלואורוגני לפרוטאז המתאים, quencher ו פלואורופור מופרדים, פלואורסצנטיות עולה. מדידות פלואורסצנטיות של הידרוג'לים דגירה עם סוג אנזים קולגנס חיידקי אחד, מראים כי האות שזוהה הנמוך ביותר הופק על ידי פקדים שליליים, ללא קולגן.
בעוד האות שזוהה הגבוה ביותר הופק על ידי 1000 מיקרוגרם לכל mL של קולגן ומעלה, כאשר האות מתחיל מישור. טווח העבודה המחושב היה בין 0.16 ל 474 מיקרוגרם לכל mL של קולגן. קריאות פלואורסצנטיות עבור קו התאים מלנומה A375, אנקפסולציה במגוון של צפיפות מיד לאחר אנקפסולציה, היו נמוכים על פני צפיפות זריעה, ובדומה ג'לים שליטה ללא תאים כצפוי.
24 שעות לאחר אנקפסולציה, פעילות MMP הייתה פרופורציונלית ישירות לצפיפות הזריעה, וצפיפות הזריעה במיליון תאים או יותר ממיליון תאים למ"ל, נמצאת בגבולות טווח העבודה. מדידות פעילות מטבולית של קו התאים A375, היו גם פרופורציונליות ישירות לצפיפות זריעת התאים. על ידי נרמול פעילות MMP לפעילות מטבולית, לא היה הבדל משמעותי בפעילות MMP לכל תא בצפיפות זריעה הגדולה מ -2 מיליון תאים ל- mL.
טכניקות צינורות נאותות חשובות. זה כולל טיפים הרטבה מראש כדי להשיג כמויות מדויקות של פתרונות צמיגים. כמו כן, מרכוג פתרון מבשר הידרוג'ל בתוך באר, הוא קריטי כדי להשיג מדידות מדויקות על ידי קורא הלוח.
כדי לזהות MMPs ספציפיים התורמים לפעילות MMP הנמדדת כאן, ניתן להשתמש בביטויים כגון כתם מערבי או PCR. השימוש בתאים חיים דורש הליך בטיחות ביולוגי תקין, טכניקה אספטית וארון בטיחות ביולוגי. אור UV הוא מסוכן, להשתמש במגן כדי להגן על המשתמש, ולא להסתכל ישירות לתוך האור.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
