7,314 Views
•
07:39 min
•
January 22, 2019
DOI:
3D-kultur gör det svårare att mäta cellulär funktion, med hjälp av vanliga biologiska analyser. Detta protokoll möjliggör mätning av cellulär och somatisk aktivitet utan ytterligare provbearbetning, med hjälp av en fluorescerande sensor och en vanlig mikroplattläsare. Detta protokoll möjliggör ett antal nya tillämpningar, inklusive hög genomströmning drog screening.
Dessutom kan lysrörssensorn bytas ut med en annan sensor för att mäta andra proteaser eller cellfunktioner. Det är viktigt att noggrant planera ut experimentet i förväg, slutföra alla beräkningar för hydrogelberedningen, och setup alla utrustningar och reagenser för att minimera tidscellerna är i suspension. Till att börja, förbereda analysen media med 1%kol avskalade Fetala bovin Serum, två mM L-glutamin, 10 enheter per mL av penicillin, och 10 mikrogram per mL streptomycin.
Använd inte fenol röda medier, som har mer fluorescens störningar. För att göra positiva kontroller, lägga till bakteriell collagenas enzym typ ett till analysen media vid koncentrationerna av 10 och 1000 mikrogram per mL. Därefter förbereder hydrogelprekursorlösningen genom att tillsätta reagenserna till ett 1,5 mL-rör.
Se till att vortexa efter tillsats av varje komponent. Dela sedan upp lösningen i flera 1,5 mL-rör för olika förhållanden. För att kapsla in celler i hydrogeler, först förbereda en enda cell suspension genom att tvätta en 10 cm maträtt av A375 melanomceller med 10 mL PBS.
Lägg sedan till 0,05%trypsin till skålen, för att provaminisera celler. Inkubera skålen vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid, i tre minuter. Efter inkubation, räkna cellerna med en hemocytometer.
Därefter centrifugera celllösningen vid 314 gånger G i tre minuter. Aspirera odlingsmedierna, och återanvända celler i PBS buffert vid ungefär tre gånger den slutliga inkapslade densiteten. Räkna cellerna igen för att säkerställa en exakt cellkoncentration.
Lägg sedan till suspenderade celler i PBS till varje rör av hydrogelprekursorlösningen enligt den erforderliga sådddensiteten, och blanda genom pipettering upp och ner. För kontrollerade förhållanden, lägg bara pbs och virvel. Därefter pipetter 10 mikroliter av hydrogel prekursorlösningen i mitten av varje brunn av en steril, svart, rundbottnad 96 väl platta.
Inspektera hydrogels placering visuellt inom brunnarna. Icke-centrerad hydrogels kan placeras om med hjälp av en pipett spets före polymerisation. För att polymerisera hydrogelprekursorlösningen, exponera plattan för UV-ljus vid 4 milliwatt per kvadratcentimeter, i tre minuter.
Därefter lägger du till 150 mikroliter av analysmedierna till alla brunnar som innehåller inkapslade celler, och 150 mikroliter av kollagenasenzymlösningen till brunnarna av positiva kontroller. Tillsätt 150 mikroliter PBS-buffert till de yttre brunnarna på plattan för att minska avdunstningen under inkubationen. Använd en mikroplattläsare för att mäta plattans fluorescerande intensitet vid noll timme, omedelbart efter inkapsling.
Välj den ogenomskinliga 96 väl plattan protokollet med 494 nanometer excitation, och 521 nanometer utsläpp våglängder. Därefter inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid, i 18 timmar. Lägg sedan till metabolisk aktivitet reagenser vid en en till 10 volym till volym förhållande per brunn för alla förhållanden och kontroller.
Inkubera plattan i 37 grader Celsius, 5%koldioxid, i sex timmar. Slutligen, mäta lysrörsintensiteten av plattan vid 24 timmar, efter inkapsling. Välj täckande 96 väl plattan protokollet, med 494 nanometer excitation, och 521 nanometer utsläpp våglängder, för MMP aktivitet.
För att mäta den metaboliska aktiviteten väljer du 560 nanometerexcitation och 590 nanometerutsläppsvåglängder. I denna studie, vid exponering av fluorogena sensorn för lämplig proteas, quencher och fluorophore separeras, och fluorescens ökar. Fluorescens mätningar av de inkuberade hydrogels med bakteriell collagenas enzym typ ett, visar att den lägsta detekterade signalen producerades av negativa kontroller, utan kollagenas.
Medan den högsta detekterade signalen producerades av 1000 mikrogram per mL av kollagenas eller ovan, när signalen börjar platå. Det beräknade arbetsområdet var från cirka 0,16 till 474 mikrogram per mL kollagenas. Fluorescens avläsningar för A375 melanom cellinje, inkapslade i en rad tätheter direkt efter inkapsling, var låg över sådd tätheter, och liknar kontroll geler utan celler som förväntat.
24 timmar efter inkapsling, var MMP verksamhet direkt proportionell mot sådddensitet, och sådddensiteter vid eller större än 1 miljon celler per mL, faller inom gränserna för arbetsområdet. Metaboliska aktivitetsmätningar av A375-cellinjen, var också direkt proportionella mot cellens sådddensitet. Genom att normalisera MMP aktivitet till metabolisk aktivitet, det fanns ingen signifikant skillnad i MMP aktivitet per cell vid seedning tätheter större än 2 miljoner celler per mL.
Korrekt pipettering tekniker är viktigt. Detta inkluderar pre-wetting tips för att uppnå exakta volymer av viskösa lösningar. Också, centrering hydrogel föregångare lösning inom brunnen, är avgörande för att uppnå exakta mätningar av plattan läsaren.
För att identifiera specifika MMPs som bidrar till MMP aktivitet mätt här, uttrycksanalyser såsom västra blot eller PCR skulle kunna användas. Användningen av levande celler kräver korrekt biosäkerhetsförfarande, aseptisk teknik och ett biologiskt säkerhetsskåp. UV-ljuset är farligt, använd en sköld för att skydda användaren och titta inte direkt in i ljuset.
Här, ett protokoll presenteras för inkapsling och odla celler i poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized med en fluorogenic matrix metalloproteinas (MMP)-nedbrytbara peptid. Cellulära MMP och metabolisk aktivitet mäts direkt från hydrogel kulturer använder en standard microplate reader.
Read Article
Cite this Article
Fakhouri, A. S., Leight, J. L. Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels. J. Vis. Exp. (143), e59123, doi:10.3791/59123 (2019).
Copy