Efter differentiering Replating av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller för hög innehåll screening av Neuritogenes och synapsen mognad

Detta protokoll underlättar användningen av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller för hög innehåll screening applikationer. Det är särskilt väl lämpad för assaying synapser, som i mänskliga nervceller kräver långa kulturperioder. Vi visar omplating av nervceller från stora format rätter i HCS-kompatibla multi wells på ett sätt som bevarar deras livskraft.

Kontraintuitivt visar vi att utvidga proteas inkubation före resuspending och replating avkastning förbättrad neuronal överlevnad. Mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller är allt mer relevanta inom områdena grundforskning, läkemedelsutveckling, och degenerativ medicin. Denna milda titreringsmetod kan användas för att återanvända alla stora mono-lager av celler som har ett tjockt nätverk av processer.

Förutom mänskliga iPSCs, det kan användas för att replate kultur av primära nervceller eller att återanvända dem för fakta sortering eller encellssekvensering. Det är viktigt att följa protokollen steg noggrant och ofta övervaka proteas medierad lossnar av nervceller från plattan. Den optimala inkubationstiden kan variera, beroende på kulturen.

Visuell demonstration gör det möjligt för även oerfarna utredare att återskapa detta förfarande. Börja med att försiktigt skölja plattan av differentierade nervceller med PBS. Skingra PBS ner väggen av plattan och inte direkt på cellerna för att undvika att störa dem.

Aspirera PBS från kanten av skålen medan tippa den, var noga med att inte röra cellerna. Applicera minst en milliliter proteolytisk enzym per 10-centimeters platta. Och återför cellerna till inkubatorn i 40 till 45 minuter.

Under inkubationen, kontrollera nervceller på en fasad kontrast mikroskop och fortsätta proteas behandlingen tills det neurala nätverket helt lossnar från plattan och börjar bryta isär. När nervcellerna har lossnat, stoppa matsmältningen genom att lägga till fem milliliter färska DEMEM media för varje milliliter proteas. Använd en serologisk pipet för att försiktigt titrera cellerna mot plattan fem till åtta gånger, se till att inte tillämpa för mycket tryck.

Sila cellerna genom ett 100 mikrometernät i ett 50 milliliter koniskt rör, dropp för droppe. Och skölj silen med ytterligare fem milliliter färska DMEM-medier. Använd en bänk-top centrifugera för att snurra cellerna ner på 1000 gånger G i fem minuter.

Efter centrifugeringen, returnera det koniska röret till biosäkerhetsskåpet och aspirera de flesta av medierna, vilket lämnar 250 mikroliter för att hålla cellerna fuktiga. Försiktigt återanvända cellerna i två milliliter av färska DMEM media sedan passera dem genom slutet av en fem milliliter serologiska pipett. Slutligen invertera röret två till tre gånger.

Använd en hemocytometer och tripan blå för att räkna de livskraftiga cellerna. Och sedan DMEM till önskad koncentration. Lägg lämpliga kosttillskott till röret, beroende på kraven i den specifika cellinjen och blanda försiktigt cellerna genom att luta koniska röret två till tre gånger.

Aspirera lamininbeläggning från en 24-brunnsplatta och skölj den en gång med PBS. Aspirera PBS. Och tillämpa celllösning på varje brunn i en figur åtta rörelse för att undvika klumpar.

När du är klar med att plätera cellerna, returnera plattan till inkubatorn inställd på 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Kort virvel stamlösningen av den tidiga celldödsreportern och lägg den till brunnarna enligt manuskriptriktningarna. Vänta i 20 minuter.

Och sedan bild levande och döda celler på glas botten multi brunnar. Förlänga proteas inkubation tillåter uppluckring av neuronala nätverket inom den lyftna ark av celler. Detta resulterar i minskad celldöd vid tidpunkten för dissociation samt resulterar i effektivare återhämtning under de följande dagarna.

Med hjälp av det utökade inkubationsförfarandet för enzymer uppvisar kulturerna en ungefärlig fördubbling av cellens livskraft under dagarna efter omplatning och en lägre densitet av döda eller döende celler. Övergångsfasen av neuronal differentiering sker under flera dagar, under vilken cellerna gradvis uttrycka sent stadium neuronala markörer. Dessa markörer omedelbart upptäcks i kulturer som var replated efter fyra veckor av pre-differentiering.

Det utökade proteasprotokollet förstärker också måttligt neuride utväxt. Både totala neuride längd och dendrit tillväxt förbättras. Omplätning är också användbart för att studera synapser.

Bara en vecka efter omplatning observerades markörer för pre- och post-synaptiska proteiner. Dessutom är elektrisk aktivitet från spontan depolarisering och synaptically-driven strömmar detekterbara med kalcium imaging eller multielektrod arrayer. Detta omplatningsförfarande kan anpassas till många typer av applikationer.

Förutom hög innehåll screening för att identifiera potentiella terapeutiska föreningar, det kan användas för imaging tillväxt kottar eller multielektrod array inspelningar. Mekanisk dissociation av nervceller som redan har bildat långa processer är stressande. Avlånga enzymatisk inkubation och skonsam titrering av celler är väsentliga steg för att lyckas med detta förfarande.