Biochemistry
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ऊतकों में प्रोटीन के स्तर की मजबूत तुलना और विकास के दौरान मानकीकृत मात्रात्मक पश्चिमी Blotting का उपयोग
Summary April 9th, 2019
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यह विधि विभिन्न ऊतकों में प्रोटीन के स्तर की तुलना के लिए और एक मानकीकृत मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए विभिन्न विकासात्मक timepoints पर एक मजबूत और reproducible दृष्टिकोण का वर्णन करता है ।
Transcript
इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न ऊतकों और समय बिंदुओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति को देखकर मौलिक और नैदानिक अनुसंधान में महत्वपूर्ण प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। विश्वसनीय मात्रात्मक पश्चिमी ब्लॉटिंग करने के लिए, हम एक आंतरिक लोडिंग नियंत्रण के साथ फ्लोरोसेंट कुल प्रोटीन दाग को जोड़ते हैं। यह प्रायोगिक परिस्थितियों में विभिन्न ऊतकों की तुलना करते समय उत्पन्न होने वाली सीमाओं पर काबू पा जाता है।
स्नैप-फ्रोजन सेल या ऊतक के नमूनों से प्रोटीन निकालने के लिए, मेज के अनुसार, नमूनों को उचित रूप से धोने से पहले बर्फ पर माइनस-८०-डिग्री नमूनों को गल लें । पॉलीप्रोपाइलीन मूसल के साथ एक हैंडहेल्ड इलेक्ट्रिक होमोजेनाइजर का उपयोग करना, धुले हुए नमूनों को समरूप बनाना, मूसल को डबल-आसुत पानी में धोना और नमूनों के बीच एक साफ ऊतक के साथ सूखना। नमूनों को 10 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें, इसके बाद अपकेंद्रित्र।
फिर, प्रोटीन-नमूना युक्त सुपरनिटेंट को गोली को परेशान किए बिना बर्फ पर एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रोटीन एकाग्रता के मात्राकरण के लिए, ट्रिपलिकेट में सांद्रता बढ़ाने पर गोजातीय सीरम एल्बुमिन मानकों की स्थापना करें, और 96-वेल ऑप्टिकल प्लेट के उपयुक्त कुओं में प्रत्येक प्रोटीन नमूने का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। 60 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक पर प्रोटीन को 10 मिनट या उससे अधिक समय तक इनक्यूबेट करें अगर प्रोटीन एकाग्रता कम होने की उम्मीद है और एक प्लेट रीडर पर 560 नैनोमीटर पर अवशोषण को मापें।
प्लेट रीडर माप का निर्यात करें और प्रोटीन मानक का उपयोग करके प्राप्त मानक वक्र के लिए प्रत्येक नमूने के औसत अवशोषण मूल्यों की तुलना करके प्रोटीन एकाग्रता की गणना करें। प्रोटीन की मात्रा को सामान्य करने के लिए, नमूना बफर और अल्ट्रा-शुद्ध पानी में प्रोटीन के नमूनों के कमजोर पड़ने को तैयार करें और 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में नमूनों को इनक्यूबेट करें। फिर, भंवर और संक्षेप में अपकेंद्रित्र से पहले बर्फ पर नमूने रखें।
इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस चैंबर सिस्टम में चार से 12% बीआईएस-ट्रिस ग्रेडिएंट जेल सेट करें और एक प्रोटीन मानक के 3.5 माइक्रोलीटर को कुएं में लोड करें। बीच-झिल्ली सामान्यीकरण के लिए आंतरिक मानक का उपयोग करते समय, प्रोटीन सीढ़ी के बगल में पहले तीन कुओं में अन्य नमूनों के बराबर राशि लोड करें और शेष कुओं में प्रत्येक नमूने के 30 माइक्रोग्राम लोड करें। फिर, 10 मिनट के लिए 80 वोल्ट पर स्टैकिंग जेल के माध्यम से नमूनों को चलाएं और इसके बाद अतिरिक्त 45 से 60 मिनट के लिए 150 वोल्ट का पालन करें।
इलेक्ट्रोफोरेसिस के अंत में, स्थानांतरण स्टैक को इकट्ठा करने के लिए, प्रोटीन जेल को नीचे के स्टैक पर रखें जिसमें फिल्टर पेपर के बाद पॉलीविनाइलिडीन डिफ्लोराइड झिल्ली होती है। किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए ब्लॉटिंग रोलर का उपयोग करें और हवा के बुलबुले को हटाने के लिए फिर से स्टैक रोलिंग से पहले फिल्टर पेपर के शीर्ष पर शीर्ष स्टैक रखें। डिवाइस के बाईं ओर इलेक्ट्रोड के साथ पूरे स्टैक को ट्रांसफर डिवाइस में स्थानांतरित करें और जेल स्पंज को स्टैक के शीर्ष पर रखें ताकि स्पंज डिवाइस पर संबंधित विद्युत संपर्कों के साथ गठबंधन हो।
ढक्कन बंद करने के बाद, उचित कार्यक्रम का चयन करें और शुरू करें। कार्यक्रम के अंत में, झिल्ली को जेल के आकार में काट लें और कुल प्रोटीन दाग के साथ जारी रखने से पहले डबल-आसुत पानी के साथ कट झिल्ली को जल्दी से धोएं। कुल प्रोटीन धुंधला के लिए, अंदर की ओर का सामना करना पड़ प्रोटीन पक्ष के साथ एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में झिल्ली रोल और एक धुएं हुड में कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए एक रोलर पर प्रोटीन दाग समाधान के पांच मिलीलीटर के साथ झिल्ली लेबल ।
इनक्यूबेशन के अंत में, धोने के समाधान के पांच मिलीलीटर के साथ झिल्ली को जल्दी से धोएं, ट्यूब को धोने के बीच रोलर में संक्षेप में लौटाएं, इसके बाद अल्ट्रा-शुद्ध पानी के साथ एक संक्षिप्त कुल्ला करें। झिल्ली में बफर को अवरुद्ध करने के तीन मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए झिल्ली को रोलर में वापस करें। उचित अनुकूलित एकाग्रता पर ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध बफर को बदलें और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर रोलर पर झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
अगले दिन, कमरे के तापमान पर रोलर पर प्रति धोने ताजा PBS के पांच मिलीलीटर के साथ पांच मिनट के लिए झिल्ली छह बार धोएं । अंतिम धोने के बाद, कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए रोलर पर उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें और इसके बाद प्रति वॉश 30 मिनट के लिए तीन वॉश करें। आखिरी धोने के बाद झिल्ली को सुखा लें और झिल्ली को प्रकाश से सुरक्षित रखने के लिए एल्यूमीनियम फॉयल का उपयोग करें।
छवि अधिग्रहण के लिए, नीचे का सामना करना पड़ प्रोटीन पक्ष के साथ स्कैनर पर झिल्ली जगह है और सॉफ्टवेयर में स्कैनिंग क्षेत्र का चयन करें । फिर, दोनों चैनलों में छवियों को प्राप्त करें और छवियों को एक उपयुक्त छवि विश्लेषण कार्यक्रम में निर्यात करें। कुल प्रोटीन धुंधला परिणाम दिखाने के लिए 700-नैनोमीटर चैनल प्रदर्शित करें और सामान्यीकरण के लिए ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए विश्लेषण का चयन करें और आयत आकर्षित करें।
फिर, कॉपी और प्रत्येक व्यक्ति के नमूने पर पहले आयत क्षेत्र पेस्ट करने के लिए परिभाषित क्षेत्र सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण गलियों के सभी के लिए एक ही आकार है । प्रत्येक लेन में प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, दोनों कुल प्रोटीन दाग और एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम के लिए ब्याज की प्रोटीन से परिणामों की नकल और उच्चतम कुल प्रोटीन दाग संकेत निर्धारित करते हैं । फिर, सामान्यीकृत प्रोटीन लोडिंग मूल्य प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कुल प्रोटीन दाग संकेत मूल्य को इस मूल्य से विभाजित करें और विभिन्न नमूनों में सापेक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति अनुपात की गणना करने के लिए प्रत्येक व्यक्ति के नमूने से 800-नैनोमीटर सिग्नल मूल्य को विभाजित करें।
इन प्रतिनिधि पश्चिमी दाग में, प्रसव के बाद के दिन पांच चूहों से प्राप्त ऊतकों से निकाले गए प्रोटीन की तुलना 10 सप्ताह पुराने वयस्क चूहों से निकाले गए प्रोटीन से की जाती है । प्रत्येक लेन पर आयत बॉक्स के अंदर फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापकर कुल प्रोटीन दाग की फ्लोरेसेंस तीव्रता का मात्राकरण हासिल किया गया था । जब पूरी लेन का विश्लेषण किया जाता है, तो फ्लोरेसेंस तीव्रता नमूनों में अपेक्षाकृत समान रहती है, यह दर्शाता है कि सामान्यीकरण के लिए कुल प्रोटीन दाग का उपयोग करना इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त है।
फ्लोरोसेंट कुल प्रोटीन दाग भी विभिन्न विकास समय बिंदुओं पर प्रोटीन के स्तर की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हालांकि जीवित रहने वाले मोटर न्यूरॉन प्रोटीन का स्तर चूहों में उम्र के साथ स्पष्ट रूप से कम हो जाता है, कुल प्रोटीन दाग मात्राकरण स्थिर रहता है। आंतरिक मानकों, फ्लोरेसेंस आधारित सामान्यीकरण और पर्याप्त आंकड़ों का उपयोग विभिन्न स्थितियों में जटिल प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की मजबूती को बढ़ाता है।
यह प्रोटोकॉल पारंपरिक पश्चिमी दाग तकनीकों को जोड़ता है, प्रयोगात्मक बैचों में उचित लोडिंग नियंत्रण और तुलना के मुद्दों पर काबू पाने, और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए लचीलापन प्रदान करता है। इस दृष्टिकोण को अन्य प्रायोगिक परिस्थितियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
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