Biochemistry
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Robuste comparaison des niveaux de protéine tissus et partout ailleurs au développement aide à éponger occidental quantitatives standardisées
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Summary April 9th, 2019
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Cette méthode décrit une approche fiable et reproductible pour la comparaison des niveaux de protéine dans différents tissus et en différents points du développement en utilisant une approche de buvard ouest quantitative standardisée.
Transcript
Ce protocole peut être utilisé pour répondre à des questions importantes dans la recherche fondamentale et clinique en examinant l’expression des protéines à travers différents tissus et points de temps. Pour effectuer des ballonnements occidentaux quantitatifs fiables, nous combinons une tache fluorescente totale de protéine avec un contrôle interne de chargement. Ceci surmonte des limitations qui surgissent en comparant divers tissus à travers des conditions expérimentales.
Pour extraire les protéines des échantillons de cellules ou de tissus congelés, décongelez les échantillons de moins-80 degrés sur la glace avant de laver les échantillons le cas échéant, selon le tableau. À l’aide d’un homogénéiseur électrique portatif avec un pilon en polypropylène, homogénéisez les échantillons lavés, rincez le pilon dans de l’eau doublement distillée et séchez-le avec un tissu propre entre les échantillons. Laissez les échantillons sur la glace pendant 10 minutes, suivis d’une centrifugation.
Ensuite, transférez le supernatant contenant des échantillons de protéines dans un nouveau tube sur glace sans déranger la pastille. Pour quantifier la concentration en protéines, établir des normes d’albumine sérique bovine à des concentrations croissantes de triplicate et ajouter un microlitre de chaque échantillon de protéines en double aux puits appropriés d’une plaque optique de 96 puits. Incuber la protéine sur un bloc thermique de 60 degrés Celsius pendant 10 minutes ou plus si la concentration en protéines devrait être faible et mesurer l’absorption à 560 nanomètres sur un lecteur de plaque.
Exportez les mesures du lecteur de plaques et calculez la concentration de protéines en comparant les valeurs moyennes d’absorption de chaque échantillon à une courbe standard obtenue à l’aide de la norme protéique. Pour normaliser la quantité de protéines, préparez des dilutions des échantillons de protéines dans l’échantillon tampon et l’eau ultra-pure et incubez les échantillons dans un bloc thermique de 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, placez les échantillons sur la glace avant de vortexer et de centrifuger brièvement.
Pour l’électrophoresis, mettre en place un gel de gradient préfabrique de quatre à 12%Bis-Tris dans le système de chambre gel électrophoresis et charger 3,5 microlitres d’une norme protéique dans le puits. Lors de l’utilisation d’une norme interne pour la normalisation entre les membranes, chargez une quantité égale aux autres échantillons dans les trois premiers puits à côté de l’échelle protéique et chargez 30 microgrammes de chaque échantillon dans les puits restants. Ensuite, faire passer les échantillons à travers le gel d’empilage à 80 volts pendant 10 minutes suivie de 150 volts pendant 45 à 60 minutes supplémentaires.
À la fin de l’électrophorèse, pour assembler la pile de transfert, placez le gel protéique sur la pile inférieure contenant la membrane de difluoride polyvinylidene suivie du papier filtre. Utilisez le rouleau de ballonnement pour enlever les bulles d’air et placez la pile supérieure sur le dessus du papier filtre avant de rouler la pile à nouveau pour enlever les bulles d’air. Transférez toute la pile dans le dispositif de transfert avec l’électrode sur le côté gauche de l’appareil et placez l’éponge de gel sur le dessus de la pile de sorte que l’éponge soit alignée avec les contacts électriques correspondants sur l’appareil.
Après avoir fermé le couvercle, sélectionnez et démarrez le programme approprié. À la fin du programme, couper la membrane à la taille du gel et laver la membrane coupée rapidement avec de l’eau double-distillée avant de continuer avec la tache totale de protéines. Pour la coloration totale des protéines, rouler la membrane dans un tube de 50 millilitres avec le côté protéique orienté vers l’intérieur et étiqueter la membrane avec cinq millilitres de solution de tache protéique sur un rouleau pendant cinq minutes à température ambiante dans une hotte de fumée.
À la fin de l’incubation, lavez rapidement la membrane avec cinq millilitres de solution de lavage, en retournant brièvement le tube au rouleau entre les lavages, suivi d’un bref rinçage à l’eau ultra-pure. Ajouter trois millilitres de tampon de blocage à la membrane et remettre la membrane au rouleau pendant 30 minutes à température ambiante. Remplacez le tampon de blocage par l’anticorps primaire d’intérêt à la concentration optimisée appropriée et incubez la membrane sur le rouleau pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, laver la membrane six fois pendant cinq minutes avec cinq millilitres de PBS frais par lavage sur le rouleau à température ambiante. Après le dernier lavage, incuber la membrane avec la solution d’anticorps secondaire appropriée sur le rouleau pendant une heure à température ambiante suivie de trois lavages pendant 30 minutes par lavage. Après le dernier lavage, séchez la membrane et utilisez du papier d’aluminium pour protéger la membrane de la lumière.
Pour l’acquisition d’images, placez la membrane sur le scanner avec le côté protéine orienté vers le bas et sélectionnez la zone de numérisation dans le logiciel. Ensuite, acquérir des images dans les deux canaux et exporter les images vers un programme d’analyse d’image approprié. Affichez le canal de 700 nanomètres pour afficher le résultat total de coloration des protéines et sélectionnez l’analyse et le rectangle de tirage pour définir la zone d’intérêt pour la normalisation.
Ensuite, copier et coller la première zone rectangle sur chaque échantillon individuel pour s’assurer que la région définie est de la même taille pour toutes les voies analysées. Pour quantifier la concentration en protéines dans chaque voie, copiez les résultats de la tache totale de protéines et de la protéine d’intérêt pour un programme de feuille de calcul et déterminez le signal de tache protéique total le plus élevé. Ensuite, divisez chaque valeur totale du signal de tache protéique par cette valeur pour obtenir la valeur normalisée de chargement des protéines et diviser la valeur du signal de 800 nanomètres de chaque échantillon individuel par sa valeur protéique normalisée correspondante pour calculer le rapport relatif d’expression des protéines dans différents échantillons.
Chez ces taches occidentales représentatives, les protéines extraites des tissus obtenus à partir de souris postnatales de cinq jours sont comparées aux protéines extraites de souris adultes âgées de 10 semaines. La quantification de l’intensité de fluorescence de la tache totale de protéine a été réalisée en mesurant l’intensité de fluorescence à l’intérieur de la boîte de rectangle sur chaque voie. Lorsque des voies entières sont analysées, l’intensité de la fluorescence demeure relativement semblable d’un échantillon à l’autre, ce qui indique que l’utilisation de la tache protéique totale pour la normalisation convient à cette fin.
La tache fluorescente totale de protéine peut également être employée pour comparer des niveaux de protéine à différents points de temps développemental. Par exemple, bien que les niveaux de protéines des motoneurones de survie diminuent clairement avec l’âge chez la souris, la quantification totale des protéines tachées demeure constante. L’utilisation de normes internes, la normalisation basée sur la fluorescence et des statistiques adéquates augmentent la robustesse de l’analyse complexe de l’expression des protéines dans différentes conditions.
Ce protocole s’ajoute aux techniques traditionnelles de tache occidentale, surmontant les problèmes des contrôles et des comparaisons appropriés de chargement entre les lots expérimentaux, et fournissant des flexibilités pour l’analyse d’expression de protéine. Cette approche peut être étendue à la comparaison de l’expression des protéines dans d’autres conditions expérimentales.
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