Login processing...

Journal / Biochemistry /

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biochemistry

Robust sammenligning af Protein niveauer på tværs af væv og udvikling ved hjælp af standardiserede kvantitative Western Blotting

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

Journal (Biochemistry)

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Journal (Biochemistry)

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Click here for the English version

Robust sammenligning af Protein niveauer på tværs af væv og udvikling ved hjælp af standardiserede kvantitative Western Blotting

Article DOI: 10.3791/59438-v • 08:13 min

April 9th, 2019 •

Yu-Ting Huang^1,2, Dinja van der Hoorn*^1,2, Leire M. Ledahawsky*^1,2, Anna A. L. Motyl*^1,2, Crispin Y. Jordan¹, Thomas H. Gillingwater^1,2, Ewout J. N. Groen^1,2

¹Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh, ²Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

April 9th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

I denne metode beskrives en robust og reproducerbar metode til sammenligning af protein niveauer i forskellige væv og på forskellige udviklingsmæssige timepoints ved hjælp af en standardiseret kvantitative western blotting tilgang.

Transcript

Denne protokol kan bruges til at behandle vigtige spørgsmål i grundforskning og klinisk forskning ved at se på proteinudtryk på tværs af forskellige væv og tidspunkter. For at udføre pålidelig kvantitativ western blotting kombinerer vi en fluorescerende totalproteinplet med en intern belastningskontrol. Dette overvinder begrænsninger, der opstår, når man sammenligner forskellige væv på tværs af eksperimentelle betingelser.

For at udtrække proteiner fra snapfrosne celle- eller vævsprøver skal de minus-80-graders prøver på is tøs op, før prøverne vaskes efter behov, alt efter tabellen. Ved hjælp af en håndholdt elektrisk homogenisator med en polypropylen støder, homogenisere de vaskede prøver, skylning støderen i dobbeltdestilleret vand og tørring med et rent væv mellem prøverne. Lad prøverne blive på is i 10 minutter efterfulgt af centrifugering.

Overfør derefter det protein-prøveholdige supernatant til et nyt rør på is uden at forstyrre pellet. Ved kvantificering af proteinkoncentrationen skal der opstilles standarder for kvægserumalbumin i stigende koncentrationer i tre eksemplarer, og der tilsættes en mikroliter af hver proteinprøve i to eksemplarer til de relevante brønde på en optisk plade med 96 brønd. Inkuber proteinet på en 60-graders-Celsius varmeblok i 10 minutter eller længere, hvis proteinkoncentrationen forventes at være lav, og mål absorptionen ved 560 nanometer på en pladelæser.

Pladelæsermålingerne udregner og beregner proteinkoncentrationen ved at sammenligne de gennemsnitlige absorbansværdier for hver prøve med en standardkurve, der er opnået ved hjælp af proteinstandarden. For at normalisere mængden af protein, forberede fortyndinger af proteinprøver i prøve buffer og ultra-rent vand og inkubere prøverne i en 70-graders-Celsius varmeblok i 10 minutter. Derefter placeres prøverne på is, før du hvirvler og kortvarigt centrifugeres.

For elektroforese, oprette en præfabrikeret fire til 12% Bis-Tris gradient gel i gel elektroforese kammer system og belastning 3,5 mikroliter af en proteinstandard i brønden. Når du bruger en intern standard for normalisering mellem membranen, skal der indlæsses en mængde, der er lig med de andre prøver, i de første tre brønde ved siden af proteinstigen og indlæs 30 mikrogram af hver prøve i de resterende brønde. Derefter køre prøverne gennem stabling gel ved 80 volt i 10 minutter efterfulgt af 150 volt i yderligere 45 til 60 minutter.

I slutningen af elektroforese, at samle overførslen stak, placere protein gel på den nederste stak, der indeholder polyvinylidene difluorid membran efterfulgt af filterpapir. Brug blotting rullen til at fjerne eventuelle luftbobler og placere den øverste stak på toppen af filterpapiret, før du ruller stakken igen for at fjerne luftbobler. Overfør hele stakken til overførselsenheden med elektroden på venstre side af enheden, og placer gelsvampen oven på stakken, så svampen flugter med de tilsvarende elektriske kontakter på enheden.

Når låget er lukket, skal du vælge og starte det relevante program. I slutningen af programmet skæres membranen til gelstørrelsen, og den afskårne membran vaskes hurtigt med dobbeltdestilleret vand, før du fortsætter med den samlede proteinplet. For total proteinfarvning rulles membranen ind i et 50-milliliterrør med proteinsiden vendt indad, og membranen mærkes med fem milliliter proteinpletopløsning på en rulle i fem minutter ved stuetemperatur i en røghætte.

Ved slutningen af inkubationen vaskes membranen hurtigt med fem milliliter vaskeopløsning, hvor røret kortvarigt returneres til rullen mellem vaskene efterfulgt af en kort skylning med ultra rent vand. Tilsæt tre milliliter blokerende buffer til membranen og returnere membranen til rullen i 30 minutter ved stuetemperatur. Udskift blokeringsbufferen med det primære interesseantistof ved den passende optimerede koncentration, og inkuber membranen på rullen natten over ved fire grader Celsius.

Den næste dag vaskes membranen seks gange i fem minutter med fem milliliter frisk PBS pr. vask på rullen ved stuetemperatur. Efter den sidste vask inkuberes membranen med den passende sekundære antistofopløsning på rullen i en time ved stuetemperatur efterfulgt af tre vaske i 30 minutter pr. vask. Efter den sidste vask, tør membranen og bruge aluminiumsfolie til at holde membranen beskyttet mod lys.

Ved billedopkøb skal membranen på scanneren med proteinsiden vende nedad og vælge scanningsområdet i softwaren. Derefter erhverve billeder i begge kanaler og eksportere billederne til et passende billedanalyse program. Vis 700-nanometerkanalen for at vise det samlede proteinfarvningsresultat og Vælg analyse og tegn rektangel for at definere interesseområdet for normalisering.

Kopier og indsæt derefter det første rektangelområde på hvert enkelt eksempel for at sikre, at det definerede område har samme størrelse for alle de analyserede baner. For at kvantificere proteinkoncentrationen i hver vognbane skal du kopiere resultaterne fra både den samlede proteinplet og det protein, der er af interesse, til et regnearksprogram og bestemme det højeste samlede proteinpletsignal. Derefter divideres hver samlet proteinpletsignalværdi med denne værdi for at opnå den normaliserede proteinbelastningsværdi, og 800-nanometersignalværdien divideres fra hver enkelt prøve med den tilsvarende normaliserede proteinværdi for at beregne det relative proteinudtryksforhold i forskellige prøver.

I disse repræsentative vestlige blots sammenlignes proteiner, der er udvundet af væv fra postnatal dag, med proteiner udvundet af 10 uger gamle voksne mus. Kvantificeringen af fluorescensintensiteten af den samlede proteinplet blev opnået ved at måle fluorescensintensiteten inde i rektangelboksen på hver vognbane. Når hele baner analyseres, forbliver fluorescensintensiteten relativt ens på tværs af prøver, hvilket indikerer, at brugen af den samlede proteinplet til normalisering er egnet til dette formål.

Den fluorescerende samlede protein plet kan også bruges til at sammenligne proteinniveauer på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter. For eksempel, selv om overlevelse motor neuron protein niveauer klart falde med alderen i mus, den samlede protein farvede kvantificering forbliver konstant. Brugen af interne standarder, fluorescensbaseret normalisering og tilstrækkelig statistik øger robustheden af kompleks proteinudtryksanalyse på tværs af forskellige forhold.

Denne protokol tilføjer til traditionelle vestlige blot teknikker, overvinde spørgsmål om passende belastning kontrol og sammenligninger på tværs af eksperimentelle partier, og giver fleksibilitet til protein udtryk analyse. Denne fremgangsmåde kan udvides til at sammenligne proteinudtryk under andre eksperimentelle forhold.

X

Simple Hit Counter