Login processing...

Journal / Biochemistry /

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biochemistry

Robust sammenligning av Protein nivå over vev og gjennom utvikling med standardiserte kvantitative vestlige Blotting

Protein Sample Setup and Crystallization

Journal (Biochemistry)

Protein Sample Setup and Crystallization

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Journal (Biochemistry)

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Click here for the English version

Robust sammenligning av Protein nivå over vev og gjennom utvikling med standardiserte kvantitative vestlige Blotting

Article DOI: 10.3791/59438-v • 08:13 min

April 9th, 2019 •

Yu-Ting Huang^1,2, Dinja van der Hoorn*^1,2, Leire M. Ledahawsky*^1,2, Anna A. L. Motyl*^1,2, Crispin Y. Jordan¹, Thomas H. Gillingwater^1,2, Ewout J. N. Groen^1,2

¹Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh, ²Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

April 9th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Denne metoden beskriver en robust og reproduserbar tilnærming for sammenligning av protein nivå i ulike vev og ulike utviklingsmessige timepoints med en standardisert kvantitative vestlige blotting tilnærming.

Transcript

Denne protokollen kan brukes til å ta opp viktige spørsmål i grunnleggende og klinisk forskning ved å se på proteinuttrykk på tvers av ulike vev og tidspunkter. For å utføre pålitelig kvantitativ vestlig blotting kombinerer vi en fluorescerende total proteinflekk med en intern lastekontroll. Dette overvinner begrensninger som oppstår når man sammenligner ulike vev på tvers av eksperimentelle forhold.

For å trekke ut proteiner fra snap-frosne celle- eller vevsprøver, tin de minus-80-graders prøvene på is før du vasker prøvene etter behov, ifølge tabellen. Bruk en håndholdt elektrisk homogenisator med en polypropylen pestle, homogenisere de vasket prøvene, skylle pestle i dobbeltdestillert vann og tørking med et rent vev mellom prøvene. La prøvene stå på is i 10 minutter, etterfulgt av sentrifugering.

Deretter overfører du proteinprøven som inneholder supernatant til et nytt rør på is uten å forstyrre pelleten. For kvantifisering av proteinkonsentrasjonen, sett opp storfe serumalbuminstandarder ved økende konsentrasjoner i triplikat, og legg til en mikroliter av hver proteinprøve i duplikat til de riktige brønnene til en 96-brønn optisk plate. Inkuber proteinet på en 60-graders Celsius varmeblokk i 10 minutter eller lenger hvis proteinkonsentrasjonen forventes å være lav og måle absorpsjonen ved 560 nanometer på en plateleser.

Eksporter platelesermålingene og beregn proteinkonsentrasjonen ved å sammenligne gjennomsnittsabsorbansverdiene for hver prøve med en standardkurve oppnådd ved hjelp av proteinstandarden. For å normalisere mengden protein, lag fortynninger av proteinprøvene i prøvebuffer og ultra rent vann og inkuber prøvene i en 70-graders Celsius varmeblokk i 10 minutter. Deretter plasserer du prøvene på is før du virvler og kort sentrifugerer.

For elektroforese, sette opp en precast fire til 12% Bis-Tris gradient gel i gel elektroforese kammer system og laste 3,5 mikroliter av en proteinstandard i brønnen. Ved bruk av en intern standard for normalisering mellom membran, last en mengde som er lik de andre prøvene i de tre første brønnene ved siden av proteinstigen og last 30 mikrogram av hver prøve inn i de resterende brønnene. Deretter kjører prøvene gjennom stablinggelen på 80 volt i 10 minutter etterfulgt av 150 volt i ytterligere 45 til 60 minutter.

På slutten av elektroforesen, for å montere overføringsstakken, legg proteingelen på den nederste stabelen som inneholder polyvinyliden difluoridemembranen etterfulgt av filterpapiret. Bruk blottingvalsen til å fjerne eventuelle luftbobler og plasser den øverste stabelen på toppen av filterpapiret før du ruller stabelen igjen for å fjerne luftbobler. Overfør hele bunken til overføringsenheten med elektroden på venstre side av enheten og plasser gelsvampen på toppen av stabelen slik at svampen er på linje med de tilsvarende elektriske kontaktene på enheten.

Når du har lukket lokket, velger du og starter det aktuelle programmet. På slutten av programmet, kutt membranen til gelstørrelsen og vask kuttmembranen raskt med dobbeltdestillert vann før du fortsetter med den totale proteinflekken. For total proteinfarging, rull membranen inn i et 50-milliliter rør med proteinsiden vendt innover og merk membranen med fem milliliter proteinflekkløsning på en rulle i fem minutter ved romtemperatur i en røykhette.

På slutten av inkubasjonen vasker du membranen raskt med fem milliliter vaskeoppløsning, og returnerer røret kort til valsen mellom vaskene, etterfulgt av en kort skyll med ultra rent vann. Tilsett tre milliliter med blokkeringsbuffer til membranen og returner membranen til valsen i 30 minutter ved romtemperatur. Erstatt blokkeringsbufferen med det primære antistoffet av interesse ved riktig optimalisert konsentrasjon og inkuber membranen på valsen over natten ved fire grader Celsius.

Neste dag vask membranen seks ganger i fem minutter med fem milliliter frisk PBS per vask på valsen ved romtemperatur. Etter siste vask, inkuber membranen med riktig sekundær antistoffløsning på valsen i en time ved romtemperatur etterfulgt av tre vasker i 30 minutter per vask. Etter siste vask tørker du membranen og bruker aluminiumsfolie for å holde membranen beskyttet mot lys.

For bildeoppkjøp plasserer du membranen på skanneren med proteinsiden vendt ned og velger skanneområdet i programvaren. Deretter kan du skaffe bilder i begge kanalene og eksportere bildene til et passende bildeanalyseprogram. Vis 700 nanometerkanalen for å vise det totale proteinfargingsresultatet og Velg analyse og tegnrektangel for å definere interesseområdet for normalisering.

Kopier og lim deretter inn det første rektangelområdet på hvert enkelt utvalg for å sikre at det definerte området har samme størrelse for alle de analyserte banene. For å kvantifisere proteinkonsentrasjonen i hvert kjørefelt, kopier resultatene fra både den totale proteinflekken og proteinet av interesse for et regnearkprogram og bestem det høyeste totale proteinflekksignalet. Deretter deler du hver totale proteinflekksignalverdi med denne verdien for å oppnå den normaliserte proteinbelastningsverdien og deler signalverdien på 800 nanometer fra hver enkelt prøve med tilsvarende normalisert proteinverdi for å beregne det relative proteinuttrykksforholdet i forskjellige prøver.

I disse representative vestlige blots, proteiner ekstrahert fra vev hentet fra post-natal dag fem mus sammenlignes med proteiner ekstrahert fra 10 uker gamle voksne mus. Kvantifisering av fluorescensintensiteten til den totale proteinflekken ble oppnådd ved å måle fluorescensintensiteten inne i rektangelboksen på hvert kjørefelt. Når hele baner analyseres, forblir fluorescensintensiteten relativt lik på tvers av prøver, noe som indikerer at bruk av den totale proteinflekken for normalisering er egnet for dette formålet.

Den fluorescerende totale proteinflekken kan også brukes til å sammenligne proteinnivåer på forskjellige utviklingstidspunkter. For eksempel, selv om overlevelsemotorneuronproteinnivåene tydelig reduseres med alderen hos mus, forblir den totale proteinfarget kvantifisering konstant. Bruken av interne standarder, fluorescensbasert normalisering og tilstrekkelig statistikk øker robustheten til kompleks proteinuttrykksanalyse på tvers av ulike forhold.

Denne protokollen legger til tradisjonelle vestlige blot teknikker, overvinne problemene med passende lasting kontroller og sammenligninger på tvers av eksperimentelle partier, og gir flexibilities for protein uttrykk analyse. Denne tilnærmingen kan utvides til å sammenligne proteinuttrykk under andre eksperimentelle forhold.

X

Simple Hit Counter