Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En metode til 3D rekonstruktion og Virtual Reality analyse af glial og neuronal celler
Chapters
Summary September 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Den beskrevne rørledning er designet til segmentering af elektronmikroskopi datasæt større end gigabytes, at udtrække helcelle morfologier. Når cellerne er rekonstrueret i 3D, kan tilpasset software designet omkring individuelle behov bruges til at udføre en kvalitativ og kvantitativ analyse direkte i 3D, også ved hjælp af Virtual Reality for at overvinde View okklusion.
Transcript
Den af automatiserede seriel sektion elektron mikroskopi teknikker. Den hastighedsbegrænsende trin i rørledningen, der fører til generering af biologiske tredimensionelle modeller billedbehandling. Vores protokol giver en trin-for-trin retningslinje til at producere en tættere konstruktion af billedvolumener på blot et par dage.
Kombineret med en tilgang til kvantitative målinger ved hjælp af tredimensionelle modeller. Med denne teknik, 3D-struktur af væv, bortset fra hjernen, kan potentielt analyseres for at identificere strukturelle funktionsnedsættelser typisk for visse sygdomme og for at forbedre den diagnostiske strategi. Segmentering er et kedeligt skridt.
Tag dig tid til at gøre det så præcist som muligt for at undgå korrekturlæsning af en dårlig segmentering og at skulle genstarte hele processen. Udformningen af softwaren undertiden ikke meget brugervenlig. Derfor er det vigtigt at se starten arbejde på segmentering.
Åbn billedstakken ved at trække og slippe den oprindelige fil fra det mikroskop, der indeholder stakken, eller købe at trække og slippe den mappe, der indeholder hele billedstakken, ind i softwarevinduet Når stakken åbnes, skal du gå til billede, egenskaber for at sikre, at voxels-størrelsen er blevet læst fra metadataene. Omdan billedet til 8-bit ved at klikke på billede, skrive og vælge 8-bit. Hvis den oprindelige stak er erhvervet som forskellige fliser, anvende syninger i TrakEM2.
Opret et nyt TrakEM2-projekt ved hjælp af New, TrakEM2 Brug trakEM2 indlejrede funktioner segment strukturer af interesse, hvis det er nødvendigt. Højreklik på alt under skabelonvinduet i TrakEM2's smattet, og vælg tilføj ny liste over underordnede områder'Træk og slip alt'i mappen under projektobjekter', og der vises noget der. Træk og slip, områdelisten'fra skabelonen til alt'placeret under projektobjekter'På billedstakken viewport skal du vælge Z-space'med markøren.
Områdelisten vises med det entydige id-nummer. Vælg brush'tool på toppen og bruge musen til at segmentere en struktur ved at udfylde det cytosol over hele Z-stack. Eksporter den segmenterede masse, der skal anvendes i Ilastik som frø til udskæring.
Det kan du gøre ved at højreklikke på 'enten på områdelisteobjektet på Z-space-listen eller på masken i visningsporten og vælge export'area list'as labels T-I-F. Afhængigt af den opløsning, der er nødvendig for yderligere rekonstruktioner, skal du reducere pixelstørrelsen på billedstakken ved at nedtagning. Overvej hukommelseskravene til den software, der skal bruges til segmentering og rekonstruktion.
Ilastik håndterer stakke på op til fem hundrede pixels på X-Y. Tag hensyn til, at den mindste størrelse, som objekterne stadig synes genkendelig og dermed kan segmenteres. Brug image'adjust size'For at forbedre kontrasten og hjælpe segmenteringen kan det uskarpe maskefilter anvendes til at gøre membranerne skarpere.
Brug process'filters'unsharp mass'Export the image stack as single images'for further processing in segmentation software, using file'save as'image sequence', og vælg TIFF'format. I de vigtigste Ilastik smattet, skal du vælge carving'modulet. Indlæs billedstakken ved hjælp af add new'og tilføj en enkelt 3D/4D-diskenhed fra sekvensen 'Vælg hele mappen', og vælg den mappe, der indeholder billedstakken gemt som enkelte filer'Nederst i det nye vindue, hvor der er mulighed for indlæsning af billederne, skal du sørge for at holde Z markeret.
For de følgende trin, kan alle operationer og knapper findes på venstre side af de vigtigste software smattet. Brug de allerede markerede standardindstillinger under fanen Forbehandling. Brug lyse linjer 'rige filtre', og hold filterskalaen på 1.600.
Denne perimeter kan ændres bagefter. Når forbehandlingen er færdig, skal du vælge den næste side i rullemenuen i mærkningsmodulet. Der findes som standard ét objekt og én baggrund.
Vælg objektet frø ved at klikke på det og tegne en linje på toppen af strukturen af interesse. Vælg derefter baggrundsfrøet, og tegn en eller flere linjer uden for det objekt, der skal rekonstrueres. Klik nu på segmentet og vent.
Afhængigt af computerens effekt og stakkens størrelse kan segmentering tage fra nogle få sekunder til timer. Når det er gjort, en semi-gennemsigtig maske fremhæve segmentering skal vises på toppen af den segmenterede struktur. Rul gennem stakken for at kontrollere segmenteringen.
Segmenteringen, måske ikke være korrekt, hvis det ikke følger strukturen af interesse eller udslip ud fra det. Ret eventuelt spild ved at placere et baggrundsfrø på den spildte segmentering. Og tilføje et objekt frø over ikke-rekonstrueret segment af objektet af interesse.
Nøjagtig visuel korrekturlæsning af segmenteringen med Ilastik kan være kedelig, men det er vigtigt at sikre, at de eksporterede objekter ikke indeholder artefakter. Hvis segmenteringen stadig ikke er korrekt, så prøv at ændre med bias'parameter, som vil øge eller mindske mængden af usikre klassificerede pixels accepteret. Det er værdien 0,95 som standard.
Reducer den for at begrænse enhver afsmittende eller stigning, hvis segmenteringen er for konservativ. En anden mulighed er at klikke på forbehandling'og ændre størrelsen af filteret. Forøgelse af værdien vil minimere salt og peber støj-lignende effekter, men vil også gøre membraner mere sløret og mindre detaljer sværere at opdage.
Dette kan begrænse afsmittende over. Gentag så meget som nødvendigt, så længe alle ønskede objekter er blevet segmenteret. Når et objekt er færdigt, skal du navigere til segment'og klikke på gem det aktuelle objekt'Der vises to nye frø for at starte segmenteringen af et nyt objekt.
Abstrakt overflade måler med det samme som O-B-J filer ved at klikke på eksport alle masker'At visualisere manuelt segmenteret modeller i 3D i TrakEM2, højreklik områdeliste, og vælg derefter show i 3D'A højere værdi vil generere en lavere opløsning mesh. Endelig eksportere 3D mesh som WaveFront O-B-J'ved at vælge fra menuen filen 'eksport overflader'WaveFront'Efter installation af neuro morph værktøjskasse som beskrevet i tekstprotokollen, åben blender. Importer objekterne ved hjælp af importen af neuroformfræse batch ved at klikke på importobjekter'under scenemenuen for at importere flere objekter på én gang.
Sørg for at aktivere, bruge re-mesh og glat skygge. Vælg det objekt, der interesserer sig for ud af foringen, og rediger Octree-dybden af re-mesh-funktionen under ændringsmenuen. Arbejde iterativt for at minimere antallet af knudepunkter og for at undgå at miste detaljer i opløsning og korrekt morfologi.
Når du ændrer Octree Dybde, mesh på de vigtigste smattet vil ændre sig i overensstemmelse hermed. Når du er færdig, skal du klikke på gælder for at færdiggøre processen. Gå til menuen neuro morph i venstre panel, og brug billedoverlejringsværktøjets billedstakinteraktioner til at indlæse billedstakken.
Sørg for at indtaste den fysiske størrelse af billedet stak for X, Y og Z og vælge stien til stakken ved at klikke på kilde Z.X og Y er ortogonale planer. De er valgfrie og indlæses kun, hvis brugeren indsætter den gyldige sti. Vælg derefter en maske på visningsporten ved at højreklikke på den.
Indtast redigeringstilstand ved at trykke på fanen, skal du vælge en eller flere knudepunkter ved hjælp af musen højreklik og endelig klikke på vis billede på knudepunkt. Et eller flere afskårne planer med mikrografen vises oven på masken. Vælg det afskårne plan ved at højreklikke på det.
Tryk derefter på kontrol Y, og rul hen over 3D-modellen ved hjælp af musens rulning. Dette kan også bruges som korrekturlæsningsmetode. Vist her er segmentering og rekonstruktion ved hjælp af TrakEM2 og Ilastik.
TrakEM2-smattet vises med objekter, der er manuelt segmenteret med rødt. Den eksporterede maske kan derefter bruges som input til semi-automatiseret segmentering. Fra Ilastik kan masker eksporteres yderligere til TrakEM2 til manuel korrekturlæsning.
Masker kan eksporteres som 3D trekantede masker til at afsløre rekonstruerede strukturer. I dette eksempel blev fire neuroner, astrocytter, mikroglia og pericytter rekonstrueret ved hjælp af denne proces. En 3D-analyse af rekonstruerede morfologier ved hjælp af tilpassede værktøjer vises.
Her er en isotropisk billedvolumen fra en fokuseret ionstråle scanning elektron mikroskopi datasæt. En tæt rekonstruktion af disse data afslører axoner, den astrocytiske proces og dendritter. Denne mikrograf viser eksempler på mål for kvantificeringer såsom synapser og astrocytiske glykogen granulat.
Masken fra denne mikrograf viser fordelingen af glykogen granulat omkring synapser. Vist her er en grafisk illustration af input og output af grafisk visualisering af glykogen-afledte laktat absorption model eller GLAM'Her, en bruger er vist iført en virtual reality eller V-R headset, mens du arbejder på den tætte rekonstruktion fra en fokuseret ion stråle scanning elektron mikroskopi datasæt. Fra en delmængde af neurites kan der observeres en fordybende V-R-scene.
Den grønne laser peger på en GLAM'peak. er af primær betydning, da den bestemmer den korrekte størrelse af de eksporterede 3D-objekter og bestemmer, at målingerne afspejler dets faktiske størrelse. Begrebet seriel sektion billeddannelse, billeddannelse segmentering og 3D-konstruktion er temmelig gammel.
Opdage den tekniske acceleration fører til fremskridt i kolekior i gennemgang af anatomi lærebøger. Selv om metoden blev udviklet til hjerneforskning i elektronmikroskopi, kan den generaliseres til enhver og mikroskopiteknik, der genererer data Desuden kan enhver form for 3D-billeddannelsesteknik drage fordel af sådanne billedsegmentering og byggeteknikker. Herunder C-T scanninger og M-R-I.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
