Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Een methode voor 3D reconstructie en Virtual Reality analyse van gliale en neuronale cellen
Chapters
Summary September 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
De beschreven pijplijn is ontworpen voor de segmentatie van elektronenmicroscopie datasets groter dan gigabytes, om hele celmorfologieën te extraheren. Zodra de cellen zijn gereconstrueerd in 3D, kan aangepaste software die is ontworpen rond individuele behoeften worden gebruikt om een kwalitatieve en kwantitatieve analyse rechtstreeks in 3D uit te voeren, ook met behulp van Virtual Reality om de zicht occlusie te overwinnen.
Transcript
De van geautomatiseerde seriële sectie elektronenmicroscopie technieken. De tariefbeperkende stap in de pijplijn die leidt tot het genereren van biologische driedimensionale modellen beeldverwerking. Ons protocol biedt een stapsgewijze richtlijn om in slechts een paar dagen een dichtere constructie van beeldvolumes te produceren.
Gecombineerd met een benadering voor kwantitatieve metingen met behulp van driedimensionale modellen. Met deze techniek kan 3D-structuur van weefsels, met uitzondering van de hersenen, mogelijk worden geanalyseerd om structurele stoornissen te identificeren die kenmerkend zijn voor bepaalde ziekten en om de diagnostische strategie te verbeteren. Segmentatie is een vervelende stap.
Neem de tijd om het zo nauwkeurig mogelijk te maken om te voorkomen dat een slechte segmentatie wordt geproefd en dat u het hele proces opnieuw moet opstarten. Het ontwerp van de software soms niet erg gebruiksvriendelijk. Daarom is het belangrijk om de start werkzaamheden aan de segmentatie te zien.
Open de afbeeldingsstapel door het oorspronkelijke bestand te slepen en te laten vallen van de microscoop met de stapel of het slepen en laten vallen van de map met de hele afbeeldingsstapel in het softwarevenster Zodra de stapel is geopend, gaan naar beeld, eigenschappen, om ervoor te zorgen dat de voxelsgrootte is gelezen uit de metagegevens. Transformeer de afbeelding in 8-bits door op afbeelding te klikken, te typen en 8-bits te selecteren. Als de oorspronkelijke stapel als verschillende tegels wordt verkregen, past u stiksels toe binnen TrakEM2.
Maak een nieuw TrakEM2-project met behulp van New, TrakEM2 Met TrakEM2 embedded functies segment structuren van belang indien nodig. Klik in de kleverige van de TrakEM2 met de rechtermuisknop op iets'onder het sjabloonvenster en selecteer de lijst met nieuwe onderliggende gebieden toevoegen'Alles slepen en neerzetten in de map, onder projectobjecten'en één alles zou daar verschijnen. Sleep en neer, de gebiedslijst'van de sjabloon naar de alles'die zich onder projectobjecten'Op de viewport van de afbeeldingsstapel selecteert u de Z-ruimte met de cursor.
De gebiedslijst wordt weergegeven met het unieke ID-nummer. Selecteer het penseelgereedschap bovenaan en gebruik de muis om een structuur te segmenteren door de cytosol over de hele Z-stack te vullen. Exporteer de gesegmenteerde massa, te gebruiken in Ilastik als zaad voor carving.
Klik hiervoor met de rechtermuisknop op het object met de gebiedslijst in de lijst met Z-ruimte of op het masker in de weergavepoort en selecteer de lijst exportgebied als T-I-F. Afhankelijk van de resolutie die nodig is voor verdere reconstructies, verkleint u de pixelgrootte van de afbeeldingsstack door down-sampling. Houd rekening met de geheugenvereisten van de software die worden gebruikt voor segmentatie en reconstructie.
Ilastik verwerkt stapels tot vijfhonderd pixels op X-Y. Houd er rekening mee dat de minimale grootte die de objecten nog steeds herkenbaar lijkt en dus kan worden gesegmenteerd. Gebruik de grootte van de afbeelding'aanpassen'Om het contrast te verbeteren en de segmentatie te helpen, kan het onscherpe maskerfilter worden toegepast om membranen scherper te maken.
Gebruik de unsharp mass van process'filters'unsharp'Exporteer de afbeeldingsstack als enkele afbeeldingen'voor verdere verwerking in segmentatiesoftware, met behulp van bestand'save as'image sequence'en kies TIFF'-indeling. Selecteer in de hoofd-Ilastik-kleverij de carving-module. Laad de afbeeldingsstack met behulp van add new'en voeg één 3D/4D-volume toe uit reeks'Selecteer hele map' en kies de map met de afbeeldingsstapel opgeslagen als afzonderlijke bestanden'Onderaan het nieuwe venster, waar opties voor het laden van de afbeeldingen aanwezig zijn, moet u Z geselecteerd houden.
Voor de volgende stappen zijn alle bewerkingen en knoppen te vinden aan de linkerkant van de hoofdsoftware. Gebruik onder het tabblad voorbewerking de standaardopties die al zijn ingeschakeld. Gebruik heldere lijnen'rijke filters'en houd de filterschaal op 1.600.
Deze omtrek kan daarna worden gewijzigd. Zodra de voorbewerking is voltooid, selecteert u de volgende pagina in het vervolgkeuzemenu van de labelmodule. Eén object en één achtergrond zijn standaard aanwezig.
Selecteer het objectzaad door erop te klikken en teken een lijn bovenop de structuur van de interesse. Selecteer vervolgens het achtergrondzaad en teken een of meerdere lijnen buiten het te reconstrueren object. Klik nu op segment en wacht.
Afhankelijk van de kracht van de computer en de grootte van de stapel kan de segmentatie enkele seconden tot uren duren. Zodra het is gedaan, een semi-transparant masker markeren van de segmentatie moet verschijnen op de top van de gesegmenteerde structuur. Blader door de stapel om de segmentatie te controleren.
De segmentatie, is mogelijk niet nauwkeurig als deze de structuur van de interesse niet volgt of er niet uit komt. Corrigeer elke spill-over door het plaatsen van een achtergrond zaad op de gemorste segmentatie. En voeg een objectzaad toe boven het niet-gereconstrueerde segment van het object van belang.
Nauwkeurige visuele proeflezen van de segmentatie met Ilastik kan vervelend zijn, maar het is essentieel om ervoor te zorgen dat de geëxporteerde objecten geen artefacten bevatten. Als de segmentatie nog steeds niet correct is, probeert u te wijzigen met de parameter bias die het aantal onzekere geclassificeerde pixels zal verhogen of verlagen. De waarde is standaard 0,95.
Verlaag het om eventuele overloop te beperken of te verhogen als de segmentatie te conservatief is. Een andere mogelijkheid is om op voorbewerking te klikken en de grootte van het filter aan te passen. Het verhogen van de waarde zal het minimaliseren van de zout en peper ruis-achtige effecten, maar zal ook membranen meer wazig en kleinere details moeilijker op te sporen.
Dit kan de overloop beperken. Herhaal zoveel als nodig is zolang alle gewenste objecten zijn gesegmenteerd. Zodra een object is voltooid, navigeer je naar segment'en klik je op huidig object opslaan'Er verschijnen twee nieuwe zaden om de segmentatie van een nieuw object te starten.
Abstract oppervlak meet meteen als O-B-J-bestanden door op export van alle mazen te klikken'Om handmatig gesegmenteerde modellen in 3D binnen TrakEM2 te visualiseren, selecteert u met de rechtermuisknop de lijst met het klikgebied en selecteert u vervolgens weergeven in 3D'A een hogere waarde genereert een mesh met een lagere resolutie. Ten slotte exporteer je het 3D-mesh als WaveFront O-B-J'door te kiezen uit het menubestand'exportoppervlakken'WaveFront'Na het installeren van de neuromorph tool kit zoals beschreven in het tekstprotocol, open blender. Importeer de objecten met behulp van de neuromorph batch importeren door te klikken op import objecten'onder het scènemenu om meerdere objecten tegelijk te importeren.
Zorg ervoor dat u re-mesh en gladde arcering activeert, gebruik maken van re-mesh en gladde arcering. Selecteer het object van belang in de out-liner en wijzig de Octree Depth van de re-mesh-functie onder het menu van de modifier. Werk iteratief om het aantal vertices te minimaliseren en om te voorkomen dat details verloren gaan in resolutie en correcte morfologie.
Bij het veranderen van de Octree Depth zal het gaas op de hoofdoever dienovereenkomstig veranderen. Zodra u klaar bent, klikt u op toepassen om het proces af te ronden. Navigeer naar het neuromorph-menu in het linkerdeelvenster en gebruik de interacties met de afbeeldingsstack van het afbeeldingsprogramma om de afbeeldingsstack te laden.
Zorg ervoor dat u de fysieke grootte van de afbeeldingsstapel voor X, Y en Z invoert en het pad van de stapel selecteert door op bron Z.X en Y te klikken, zijn orthogonale vlakken. Ze zijn optioneel en worden alleen geladen als de gebruiker het geldige pad invoegt. Selecteer vervolgens een gaas op de weergavepoort door er met de rechtermuisknop op te klikken.
Voer de bewerkingsmodus in door op het tabblad te drukken, selecteer een of meer vertices met de rechtermuisknop en klik uiteindelijk op de afbeelding weergeven op vertex. Een of meer gesneden vlakken met de micrograaf verschijnen bovenop het gaas. Selecteer het uitgesneden vlak door er met de rechtermuisknop op te klikken.
Druk vervolgens op control Y en scroll over het 3D-model met de muisscroll. Dit kan ook worden gebruikt als proeflezen methode. Hier is de segmentatie en reconstructie met TrakEM2 en Ilastik.
De TrakEM2 kleverige wordt getoond met objecten handmatig gesegmenteerd in het rood. Het geëxporteerde masker kan vervolgens worden gebruikt als invoer voor semi-geautomatiseerde segmentatie. Vanaf Ilastik kunnen maskers verder worden geëxporteerd naar TrakEM2 voor handmatige proeflezen.
Maskers kunnen worden geëxporteerd als 3D driehoekige mazen om gereconstrueerde structuren te onthullen. In dit voorbeeld werden vier neuronen, astrocyten, microglia en pericyten gereconstrueerd met behulp van dit proces. Een 3D-analyse van gereconstrueerde morfologieën met behulp van aangepaste gereedschappen wordt getoond.
Hier is een isotropische beeldvolume van een gerichte ionenbundel scannen elektronen microscopie data set. Een dichte reconstructie van deze gegevens onthult axonen, het astrocytische proces en dendrieten. Deze micrograaf toont voorbeelden van doelen voor kwantificeringen zoals synapsen en astrocytische glycogeenkorrels.
Het masker van die micrograaf toont de verdeling van glycogeenkorrels rond synapsen. Hier is een grafische illustratie van de input en output van grafische visualisatie van het glycogeen-afgeleide lactaatabsorptiemodel of GLAM'Hier wordt een gebruiker getoond die een virtual reality of V-R headset draagt terwijl hij werkt aan de dichte reconstructie van een gerichte ionenbundel scanning elektronenmicroscopie dataset. Vanuit een subset van neurites kan een meeslepende V-R-scène worden waargenomen.
De groene laser wijst naar een GLAM'peak. is van primair belang omdat het de juiste grootte van de geëxporteerde 3D-objecten bepaalt en de metingen ervan de werkelijke grootte ervan bepaalt. Het concept van seriële sectie beeldvorming, imaging segmentatie en 3D-constructie is vrij oud.
Het ontdekken van de technische versnelling leidt tot vooruitgang in colectomies in de herziening van de anatomie leerboeken. Hoewel de methode is ontwikkeld voor hersenonderzoek in elektronenmicroscopie, kan deze worden gegeneraliseerd tot elke en microscopietechniek die gegevens genereert Verder kan elke vorm van 3D-beeldvormingstechniek profiteren van dergelijke beeldsegmentatie- en constructietechnieken. Inclusief C-T scans en M-R-I.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
