Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In vivo intracerebrale Stereotaxic injecties voor Optogenetische stimulatie van lange-afstand ingangen in muis hersenen segmenten
Chapters
Summary September 20th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit protocol beschrijft een reeks methoden voor het identificeren van de cel-type specifieke functionele connectiviteit van lange-bereik ingangen van verre hersengebieden met behulp van optogenetische stimulaties in ex vivo hersenen segmenten.
Transcript
Het doel van deze methode is het identificeren van de functionele connectiviteit van lange afstand ingangen uit verre hersengebieden met behulp van fototimulatie in de hersenen plakjes. De stereotaxic targeting van een specifiek hersengebied voor verschillende gemedieerde expressie van lichtgevoelige ionkanalen maakt de selectieve stimulatie van axonen afkomstig uit dat gebied met licht mogelijk. Het demonstreren van de procedure zal Louis Richevaux, een promovendus uit mijn fractie.
Controleer vóór de operatie of het dier goed verdoofd is met een teensnuifje. Trek voorzichtig zijn tong om de ademhaling te vergemakkelijken. Scheer vervolgens het schedelhaar.
Injecteer 20 microliters lidocaïnehydrochloride onder de huid van het hoofd op lokale anesthesie en wacht vijf minuten. Om de schedel bloot te leggen, maak een snee op de hoofdhuid. Plaats het dier vervolgens in een stereotaxic frame.
Steek de oorbalken en laat ze op de botten iets rostral aan de oren en trek de huid naar beneden om een goede toegang tot de schedel te creëren. Draai de oorbalken aan en installeer het neusstuk. Onderhoud het lichaam van het dier horizontaal en op het niveau van de kop met behulp van een hoogte-aangepaste ondersteuning.
Plaats een verwarmingskussen onder het dier om het op fysiologische temperatuur te houden. Maak vervolgens de schedel schoon door 0,9% natriumchloride aan te brengen met een wattenstaafje om zacht weefsel te verwijderen. Pas de schedel zo aan dat de bregma lambda-toegang wordt genivelleerd.
Zoek vervolgens de injectieplaats op de schedel volgens de achterste en mediale coördinaten en plaats de injectienaald erboven. Markeer de schedel met een wegwerpnaald. Beweeg vervolgens de injectienaald met vier centimeter omhoog.
Met behulp van een 0,5 millimeter braam, maak een een millimeter diameter craniotomie op het merk op de helft van de maximale snelheid. Watstaafje met een weefsel als er bloedingen optreden. Vervolgens leeg het water in de Hamilton spuit voor opslag door het volledig uitwerpen met een pomp.
Alleen de naald is gevuld met water. Ontdooi de virale oplossing om op ijs te worden geïnjecteerd, verwijder deze vervolgens kort uit het ijs en verkrijg 700 nanoplegers van de oplossing met een micropipet. Vervolgens, deponeren een druppel op een stuk paraffine film.
Plaats de paraffinefilm bovenop de craniotomie. Duik de naald in de druppel virale oplossing zonder de anteroposterior en laterale positie te veranderen. Gebruik daarna de uittrekfunctie van de pomp om de spuit te vullen met ongeveer 500 nanoliters van de virale oplossing op de paraffinefilm.
Voer deze procedure uit onder de stereoscoop, bekijk de druppel verdwijnen en zorg ervoor dat er geen lucht wordt aangezogen. Zorg ervoor dat de spuit correct is gevuld. Test het uitwerpsysteem door de zuiger naar beneden te rijden om een kleine druppel vloeistof te testen.
Steek vervolgens de naald in de hersenen op de gekozen diepte. Druk op de run-knop voor injectie. Trek vervolgens de naald langzaam gedurende drie tot vijf minuten.
Was de naald onmiddellijk in schoon gedestilleerd water door het meerdere keren te legen om verstopping te voorkomen. Verwijder het dier daarna uit het stereotaxicframe. Hecht de huid en maak drie of vier hechtingen gebonden met 2-1-1 standaard chirurgische knopen.
Om de hersenen te extraheren, maak een snee op de huid van de nek tot de neus, dan sectie van de laatste wervels uit de schedel met een schaar. Trek de huid in en snijd de schedel langs de middellijn van caudal naar rostral richting. Verwijder voorzichtig het pariëtale bot en het staartstuk van het frontale bot.
Haal de hersenen met een kleine afgeronde spatel door het invoegen tussen de hersenen en de schedelvloer, sectie van de olfactorische bol, oogzenuw, en andere craniale zenuwen en cerebellum. Dompelen de hersenen voorzichtig onder in ijskoude snijoplossing. Breng vervolgens de hersenen over op een filterpapier en droog het corticale oppervlak voorzichtig.
Lijm de hersenschors aan de monsterhouder van een vibratome met de staartzijde naar het blad om horizontale hersenschijfjes te snijden. Vul vervolgens de snijkamer met ijskoude zuurstofhoudende snijoplossing, zodat de hersenen volledig worden samengevoegd. Sectie 300 micrometer dikke plakjes met de vibratome met een snelheid van 07 millimeter per seconde bij een millimeter amplitude.
In dit stadium is het raadzaam om de Chronos-GFP-expressie in de thalamus kort te controleren met behulp van een fluorescerende zaklamp en bijbehorende filterbril. Om hele-cel patch-clamp opname uit te voeren, breng voorzichtig een hersenschijf met het hippocampal complex over naar de opnamekamer. Continu doorsnuf de opnamekamer met 34 graden Celsius ACSF borrelde met carbogen op twee tot drie milliliter per minuut.
Onderzoek chronos-GFP expressie kort in axon terminals in de regio van belang met blauwe LED-verlichting bij 4X vergroting. Verander in een 63X onderdompelingsdoelstelling en pas de focus aan. Controleer op axonen die Chronos-GFP uitdrukken en kies een piramidale neuron voor patchopname.
Vul vervolgens een pipet met kaliumgluconaat gebaseerde interne oplossing. Monteer het in de pipethouder op het hoofdpodium. Patch de cel in spanningsklem configuratie.
Nader het geïdentificeerde neuron en druk de pipetpunt subtiel op de soma. De positieve druk moet een kuiltje op het membraanoppervlak produceren. Laat vervolgens de druk los om een gigoOm-afdichting te maken.
Eenmaal verzegeld, stel de holding spanning op min 65 millivolt. Breek het membraan met een scherpe puls van negatieve druk. Noteer de reacties van het neuron op het hyperpolariseren en depolariseren van de huidige stappen in de hele cel stroomklemmodus.
Record in de huidige of spanning klem postsynaptische reacties op 475 nanometer LED hele-veld stimulatie van afferent vezels uitdrukken Chronos. Stimuleer met treinen van tien stimulaties van twee milliseconden duur op 20 hertz. De activiteit van presuble neuronen in laag drie in reactie op het hyperpolariseren en depolariseren van de huidige stappen werd geregistreerd in de hele cel patch-klem configuratie.
Stimulerend ADN axon terminals uitdrukken Chronos-GFP ontlokte excitatory post-synaptische potentialen in presubiculaire laag drie hoofdcellen in de huidige klemmodus. Afhankelijk van de lichtintensiteit kunnen de EPSP's de potentiële drempel voor actie bereiken. Post-synaptische reacties werden ook waargenomen in de spanningsklemmodus, omdat excitatory post-synaptische stromen werden opgewekt.
Hier is een laag drie piramidale neuron omgeven door thalamische axonen uitdrukken Chronos-GFP in presubiculaire oppervlakkige lagen met DAPI kleuring afgebeeld met een epifluorescentie microscoop. En dit beeld werd genomen bij een hogere vergroting met een confocale microscoop. Zorgvuldige nivellering van de bregma langs de as bij het uitvoeren van proefexperimenten met een fluorescerende tracer zijn cruciaal om de precisie van de stereotaxic-injectie te verbeteren.
Deze procedure kan ook worden gebruikt om convergerende projecties uit verschillende gebieden te onderzoeken door te injecteren op twee generatieve scène gevoelig voor twee verschillende golflengten. De ontwikkeling van deze techniek heeft nauwkeurige anatomische en functionele kringanalyse tussen verre hersenengebieden op een celtype specifieke manier mogelijk gemaakt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
