माउस मस्तिष्क स्लाइस में लंबी-रेंज इनपुट के Optogenetic उत्तेजना के लिए Vivo Intracerebral Stereotaxic इंजेक्शन में

इस विधि का उद्देश्य मस्तिष्क स्लाइस में फोटोस्मुलेशन का उपयोग करके दूर के मस्तिष्क क्षेत्रों से लंबी दूरी के आदानों की कार्यात्मक कनेक्टिविटी की पहचान करना है। प्रकाश संवेदनशील आयन चैनलों की विभिन्न मध्यस्थता अभिव्यक्ति के लिए एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र का स्टीरियोटैक्सिक लक्ष्यीकरण प्रकाश के साथ उस क्षेत्र से आने वाले अक्षों की चयनात्मक उत्तेजना की अनुमति देता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन लुई Richevaux, मेरे समूह से एक पीएचडी के छात्र होगा ।

सर्जरी से पहले, सत्यापित करें कि जानवर अच्छी तरह से एक अंगुली चुटकी के साथ एनेस्थेटाइज्ड है। धीरे से सांस लेने की सुविधा के लिए अपनी जीभ बाहर खींचो। इसके बाद कपाल के बालों को शेव करें।

स्थानीय संज्ञाहरण के लिए सिर की त्वचा के नीचे लिडोकेन हाइड्रोक्लोराइड के 20 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें और पांच मिनट इंतजार करें। खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए, खोपड़ी पर एक कट बनाएं। इसके बाद जानवर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रखें।

कान की सलाखों डालें और उन्हें हड्डियों पर आराम करें कानों में थोड़ा रॉक्रल करें और खोपड़ी तक अच्छी पहुंच बनाने के लिए त्वचा को नीचे खींचें। कान की सलाखों को कस लें और नाक के टुकड़े को स्थापित करें। ऊंचाई-समायोजित समर्थन का उपयोग करके जानवर के शरीर को क्षैतिज रूप से और सिर के स्तर पर बनाए रखें।

शारीरिक तापमान पर रखने के लिए जानवर के नीचे एक हीटिंग पैड रखें। फिर नरम ऊतक को हटाने के लिए एक कपास झाड़ू के साथ 0.9% सोडियम क्लोराइड लगाने से खोपड़ी को साफ करें। खोपड़ी को समायोजित करें ताकि ब्रेग्मा लैम्ब्डा एक्सेस समतल हो।

फिर, पीछे और औसत के बाद निर्देशांक के अनुसार खोपड़ी पर इंजेक्शन साइट का पता लगाएं और इसके ऊपर इंजेक्शन सुई की स्थिति। खोपड़ी को डिस्पोजेबल सुई से चिह्नित करें। इसके बाद इंजेक्शन की सुई को चार सेंटीमीटर ऊपर ले जाएं।

0.5 मिलीमीटर बर्र का उपयोग करके, अधिकतम गति के एक आधे हिस्से पर निशान पर एक मिलीमीटर व्यास क्रैनिओटॉमी बनाएं। यदि कोई रक्तस्राव होता है तो ऊतक के साथ झाड़ू। इसके बाद, स्टोरेज के लिए हैमिल्टन सिरिंज में निहित पानी को पूरी तरह से पंप से बाहर निकालकर खाली करें।

सिर्फ सुई से पानी भरा जाता है। बर्फ पर इंजेक्ट किए जाने वाले वायरल समाधान को पिघलाएं, फिर, संक्षेप में इसे बर्फ से हटा दें और एक माइक्रोपिपेट के साथ समाधान के 700 नैनोलीटर प्राप्त करें। इसके बाद, पैराफिन फिल्म के एक टुकड़े पर एक बूंद जमा करें।

पैराफिन फिल्म को क्रैनिओटॉमी के ऊपर रखें। एंटीरोडेर और पार्श्व स्थिति को बदले बिना वायरल समाधान की बूंद में सुई डुबकी। इसके बाद, पैराफिन फिल्म पर वायरल समाधान के लगभग 500 नैनोलीटर के साथ सिरिंज को भरने के लिए पंप के वापस लेने के कार्य का उपयोग करें।

स्टीरियोस्कोप के तहत इस प्रक्रिया को करें, ड्रॉप को गायब देखें, और सुनिश्चित करें कि किसी भी हवा को एस्पिरेट न करें। सुनिश्चित करें कि सिरिंज सही ढंग से भर दिया गया है। तरल की एक छोटी बूंद को बाहर निकालने के लिए प्लंजर को नीचे चलाकर रिजेक्शन सिस्टम का परीक्षण करें।

बाद में, चुनी हुई गहराई में सुई को मस्तिष्क में डालें। इंजेक्शन के लिए रन बटन पुश करें। फिर, धीरे-धीरे तीन से पांच मिनट से अधिक सुई वापस लें।

क्लोजिंग से बचने के लिए कई बार खाली करके सुई को साफ आसुत पानी में तुरंत धोएं। इसके बाद, स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से जानवर को हटा दें। त्वचा को सीवन करें और 2-1-1 मानक सर्जिकल नॉट के साथ बंधे तीन या चार टांके बनाएं।

मस्तिष्क निकालने के लिए, गर्दन से नाक तक त्वचा पर एक कट बनाएं, फिर कैंची के साथ खोपड़ी से अंतिम कशेरुकी को अनुभाग करें। त्वचा को वापस लें और मिडलाइन के साथ खोपड़ी को कौडल से रोस्ट्रल दिशा में काट लें। ललाट की हड्डी के पार्श्व की हड्डी और कौंडल भाग को सावधानी से हटा दें।

मस्तिष्क और कपाल तल के बीच इसे डालकर एक छोटे गोल स्पैटुला के साथ मस्तिष्क निकालें, घ्राण बल्ब, ऑप्टिक तंत्रिका, और अन्य कपाल तंत्रिकाओं और सेरिबैलम को खंडित करें। धीरे-धीरे बर्फ ठंड काटने के समाधान में मस्तिष्क जलमग्न। बाद में, मस्तिष्क को एक फिल्टर पेपर में स्थानांतरित करें और धीरे-धीरे कॉर्टिकल सतह को सुखाएं।

क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइस को काटने के लिए ब्लेड का सामना कर रहे कौडल पक्ष के साथ एक वाइब्रेकोम के नमूना धारक को मस्तिष्क कॉर्टेक्स गोंद करें। इसके बाद, काटने वाले कक्ष को बर्फ के ठंडे ऑक्सीजनयुक्त काटने के समाधान से भरें ताकि मस्तिष्क पूरी तरह से स्थिर हो जाए। धारा 300 माइक्रोमीटर मोटी स्लाइस एक मिलीमीटर आयाम पर 07 मिलीमीटर प्रति सेकंड की गति से वाइब्रेटरोम के साथ।

इस स्तर पर, फ्लोरोसेंट टॉर्च और इसी फिल्टर चश्मे का उपयोग करके थैलेसीमिया में क्रोनोस-जीएफपी अभिव्यक्ति की संक्षेप में जांच करने की सिफारिश की जाती है। पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग करने के लिए, धीरे-धीरे रिकॉर्डिंग कक्ष में हिप्पोकैम्पल परिसर युक्त एक मस्तिष्क टुकड़ा स्थानांतरित करें। लगातार 34 डिग्री सेल्सियस ACSF के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर को दो से तीन मिलीलीटर प्रति मिनट पर कार्बोजन के साथ बुलबुला।

संक्षेप में 4X आवर्धन पर नीले एलईडी रोशनी के साथ ब्याज के क्षेत्र में एक्सोन टर्मिनलों में क्रोनोस-जीएफपी अभिव्यक्ति की जांच करें। 63X विसर्जन उद्देश्य में बदलें और ध्यान समायोजित करें। क्रोनोस-जीएफपी को व्यक्त करते हुए एक्सॉन की जांच करें और पैच रिकॉर्डिंग के लिए एक पिरामिड न्यूरॉन चुनें।

इसके बाद, पोटेशियम ग्लूकोनेट आधारित आंतरिक समाधान के साथ एक पिपेट भरें। इसे सिर के चरण पर पिपेट धारक में माउंट करें। वोल्टेज क्लैंप विन्यास में सेल पैच।

पहचाने गए न्यूरॉन से संपर्क करें और सोमा पर पिपेट टिप को नाजुक रूप से दबाए। सकारात्मक दबाव झिल्ली की सतह पर एक डिंपल का उत्पादन करना चाहिए। फिर, एक गीगोम सील बनाने के लिए दबाव जारी करें।

एक बार सील होने के बाद, होल्डिंग वोल्टेज को माइनस 65 मिलीवोल्ट्स पर सेट करें। नकारात्मक दबाव की तेज नब्ज से झिल्ली को तोड़ें। पूरे सेल वर्तमान क्लैंप मोड में वर्तमान चरणों को हाइपरपोलेराइज करने और डीपोलराइज करने के लिए न्यूरॉन की प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करें।

वर्तमान या वोल्टेज क्लैंप पोस्टसिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं में रिकॉर्ड 475 नैनोमीटर एलईडी पूरे क्षेत्र उत्तेजना के लिए क्रोनोस व्यक्त करते हैं। 20 हर्ट्ज पर दो मिलीसेकंड अवधि के दस उत्तेजनाओं की गाड़ियों के साथ उत्तेजित करें। हाइपरपोलेरेशन और डिपोलराइजिंग वर्तमान चरणों के जवाब में परत तीन में प्रीसुबिकुलर न्यूरॉन्स की गतिविधि पूरे सेल पैच-क्लैंप विन्यास में दर्ज की गई थी।

क्रोनोस-जीएफपी को व्यक्त करने वाले एडीएन एक्सॉन टर्मिनलों को उत्तेजित करते हुए वर्तमान क्लैंप मोड में प्रीसुबिकुलर लेयर थ्री प्रिंसिपल कोशिकाओं में उत्तेजक उत्तेजक पोस्ट-सिनेप्टिक क्षमता। प्रकाश तीव्रता के आधार पर, ईपीएसपी कार्रवाई संभावित सीमा तक पहुंच सकता है। वोल्टेज क्लैंप मोड में पोस्ट-सिनैप्टिक प्रतिक्रियाएं भी देखी गईं, क्योंकि उत्तेजक पोस्ट-सिनैप्टिक धाराओं को प्राप्त किया गया था।

यहां दिखाया गया एक परत तीन पिरामिड न्यूरॉन है जो थैलेसीमिक एक्सॉन से घिरा हुआ है जो प्रीसुबिकुलर सतही परतों में क्रोनोस-जीएफपी को व्यक्त करता है जिसमें एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग डैपी धुंधला होता है। और इस छवि को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ एक उच्च आवर्धन पर लिया गया था। फ्लोरोसेंट ट्रेसर के साथ पायलट प्रयोगों को करने में धुरी के साथ ब्रेग्मा का सावधानीपूर्वक लेवलिंग स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन की सटीकता में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है।

इस प्रक्रिया का उपयोग दो अलग-अलग तरंगदैर्ध्य के प्रति संवेदनशील दो जनरेटिव दृश्य पर इंजेक्शन देकर विभिन्न क्षेत्रों से अभिसरण अनुमानों की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है। इस तकनीक के विकास ने कोशिका प्रकार विशिष्ट तरीके से दूर के मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच सटीक शारीरिक और कार्यात्मक सर्किट विश्लेषण की अनुमति दी है।