Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Berigelse af Native lipoprotein partikler med microRNA og efterfølgende bestemmelse af deres absolutte/relative microRNA indhold og deres cellulære overførselshastighed
Chapters
Summary May 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenteres en kvantitativ real-time polymerase kæde reaktions baseret protokol til bestemmelse af det oprindelige Micro-RNA indhold (absolutte/relative) af lipoprotein partikler. Desuden er en metode til at øge mikro-RNA-niveauet, samt en metode til bestemmelse af cellulære optagelse sats af lipoprotein partikler, påvist.
Transcript
Lipoprotein partikler er indfødte transportkøretøjer. Berigelse af fremmede stoffer gør det lettere at anvende dem som sporbærer. Specifik mærkning af molekyler eller hele partikler gør det muligt at måle den cellulære optagelse.
De to metoder til berigelse er hurtige og nemme at anvende og kan tilpasses til en lang række stoffer. Demonstration af proceduren vil være Markus Axmann og Andreas Karner, to postdocs fra mit laboratorium. Til at begynde afdædning i en røghætte blandes en til to milliliter forberedt HDL-opløsning, der indeholder fem milligram HDL-partikler, med 50 milliliter forkølet tre-til-to blanding af ethanoldiethylether i et konisk centrifugeringsrør.
Inkubere i to timer ved negative 20 grader Celsius. Centrifuge ved 2500 gange g i 10 minutter ved negative 10 grader Celsius. Kassér supernatanten, opslæmp pellet i 50 milliliter forkølet ethanol diethyl ether blanding, og vortex kort.
Inkuber en anden gang i to timer ved negative 20 grader Celsius. Centrifuge igen ved 2500 gange g i 10 minutter ved negative 10 grader Celsius. Derefter indsætte slanger leverer kvælstof gas flow til at tørre pellet.
Og resuspend det i 250 mikroliter af buffer A.Determine proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford protein assay eller en anden passende. Det er afgørende at fjerne eventuelle rester af ethanol diethyl ether blandingen, da disse opløsningsmidler ville hæmme relipidation af apolipoproteiner. Dernæst fortyndes til en endelig koncentration af en milligram protein pr 250 mikroliter buffer A.Indsæt en slange, der leverer inert gas i opløsningsdelen i røret.
Hvis det er nødvendigt, opbevares opløsningen natten over ved fire grader Celsius under den inerte gasatmosfære. For at begynde rekonstitution, i et rent glasrør, bland 100 mikroliter CO, 13,5 mikroliter C, og 500 mikroliter pc. Drej derefter glasrøret, mens nitrogengassen skylles inde i røret for at tørre blandingen for at give et homogent overfladelag. I et 0,5 milliliter reaktionsrør fremstilles en frisk 30-millimolar spermineopløsning i buffer A.Bland derefter 100 mikroliter af 10-mikromolar syntetisk mikroRNA med 100 mikroliter sperminopløsning i et to milliliter reaktionsrør.
Og inkubere i 30 minutter ved 30 grader Celsius. Dernæst overføres den inkuberede 200-mikroliteropløsning til glasrøret for at rehydrere det forberedte PC-CO-C mastermix overfladelag. Og derefter tilføje 50 mikroliter af en 30 milligram per milliliter natrium deoxycholate opløsning.
Rør ved fire grader Celsius i to timer. Derefter tilsættes 250 mikroliter af den afvængede HDL-opløsning i glasrøret. Og rør ved fire grader Celsius natten over.
For at begynde dialyse, først tilføje 50 gram adsorbent perler til 800 milliliter dobbelt-destilleret vand. Og brug en magnetisk omrører til at røre i et minut. Vent 15 minutter for perlerne at bosætte sig, og dekantere supernatant.
Gentag proceduren med forkølet PBS. Fortætte dialysekassetter i PBS. Brug en sprøjte til at lægge den tidligere forberedte blanding i kassetterne i overensstemmelse med producentens anvisninger.
Tilsæt PBS-behandlede adsorbent perler til tre liter PBS, og læg kassetterne i PBS til dialyze ved fire grader Celsius. Perlerne holder tætheden gradient langs dialyse membran konstant. Skift buffer og perlerne efter en time og to timer.
Efter 24 timer, med en sprøjte, skal opløsningen trækkes ud af kassetten i et 1,5 milliliter reaktionsrør for at genvinde den rekonstituerede HDL-partikelopløsning. Proteinkoncentrationen bestemmes ved hjælp af Bradford-analysen. Der leveres inert gas til reaktionsrøret, forsegles og den rekonstituerede HDL-partikelopløsning opbevares under inert gasatmosfære ved fire grader Celsius.
Først forberede en frisk 30-millimolar spermine opløsning i RNAse-fri vand. Bland 100 mikroliter af 10 mikromolar syntetisk mikroRNA med 100 mikroliter spermineopløsning i et to milliliter reaktionsrør. Og inkubere i 30 minutter ved 30 grader Celsius.
Derefter tilsættes 100 mikroliter DMSO og 1,2 milliliter 1X LDL buffer til den forberedte microRNA spermine opløsning. Fortyndes tidligere fremstillet LDL partikelopløsning med PBS til en endelig koncentration på ca. 4 mg/ml. Træk derefter 450 mikroliter af den fortyndede opløsning ind i et 1,5 milliliter reaktionsrør, og bland med 50 mikroliter af 10X LDL buffer.
Inkuber den i 10 minutter på is. Efter inkubationen kombineres 500-mikroliter LDL-partikelopløsningen og 1,5-milliliter microRNA-spermine-DMSO-opløsningen, og den inkuberes i to timer ved 40 grader Celsius. Udfør dialyse lignende som tidligere beskrevet, og opbevar den mærkede LDL partikelopløsning under inert gasatmosfære ved fire grader Celsius.
Til at begynde, fortyndes HDL eller LDL partikelopløsning i PBS mellem en-til-100 og en-til-1, 000. Kløve glimmer ved at trykke tape mod glimmer substrat, og trække båndet ud for at fjerne de øverste glimmer lag. Brug en pipette til at deponere to mikroliter på nykløveret glimmer til at inkubere i fem minutter.
Lipoprotein partikler tendens til at danne kontinuerlig binding membraner på overflader. Derfor er det vigtigt at justere partikelkoncentrationen på glimmeroverfladen for at få individuelle. Efter inkubation skylles prøven med PBS.
Fyld højhastigheds-AFM-væskecellen med PBS, og monter den glimmerbærende scanner til højhastigheds-AFM-fasen. I kontrol-software, starte tilgangsprocessen af cantilever til glimmer overflade. Brug scanningsstørrelser mindre end et kvadratisk mikrometer, og hold billedkræfterne så lave som muligt.
Billede eksemplet i trykketilstand. Indlæs dataene i Gwyddion, og detekter partiklerne via mærkekornene ved tærskelfunktion. Juster højdetærsklensværdien for at maskere de enkelte partikler.
Normalt er et niveau på omkring 50% et godt udgangspunkt. Fjern polynomial baggrund for at samkopiere billedet, og aktivér indstillingen Udeluk maskeret område. Eksporter de maksimale højdeværdier for de fundne partikler ved hjælp af fordelingen af forskellige kornegenskaber funktion, og gentag disse trin for alle optagede billeder.
I dette eksperiment blev rekonstitution af HDL-partikler udført gennem afdæbning af HDL-partikler efterfulgt af relipidation og dialyse. Der kan opnås et udbytte på 50 % rekonstituerede HDL-partikler. Den samme mærkning med microRNA var imidlertid ikke mulig for mærkning af LDL-partikler på grund af hydrofomboliiteten af apolipoprotein B100-proteinet.
DMSO blev således anvendt til indtrængning af lipidmonstræber af LDL-partiklerne, med et udbytte tæt på 100% Under kvalitetskontrol er fortyndingen afgørende for analyse. Det øverste billede viser en for høj partikeltæthed. Det nederste billede er egnet til analyse.
Sandsynlighedstæthedsfunktioner af partikelhøjder blev beregnet til sammenligning af størrelsesfordelinger af de oprindelige, mærkede og mærkede kontrol lipoproteinpartikler. Den relative ændring før og efter mærkningsproceduren kan forsømmes. Ved håndtering af RNA oligonukleotider skal du arbejde RNAse-fri.
Brug friske engangsplastforbrugsstoffer, og brug altid handsker. Brug kun nukleasefri løsninger. High-speed AFM er blot én metode til at bestemme den generelle form af lipoproteiner.
En alternativ metode ville være elektronmikroskopi. Bær passende personligt beskyttelsesudstyr, og arbejd i en røghætte, mens du håndterer diethylether.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
