Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Определение плотности bile Duct в мышечной печени
Chapters
Summary April 30th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Мы представляем довольно простой и чувствительный метод для точной количественной оценки плотности желчных протоков в печени мыши. Этот метод может помочь в определении воздействия генетических и экологических модификаторов и эффективности потенциальных методов лечения в мышиных моделях желчных заболеваний.
Transcript
Этот протокол позволяет исследователю количественно развития желчных протоков в мышиных моделях заболеваний печени. Это также позволяет оценить влияние генетических модификаторов на развитие желчных протоков. Преимущество этого метода заключается в том, что он является простым, чувствительным и количественным методом для прямой оценки развития желчных протоков.
Для начала, с кожей, протянутой натянутой на типсы, используйте небольшие ножницы, чтобы сделать поперечный разрез примерно на один дюйм ниже грудной клетки усыпляемой мыши. Выставить всю вентраловую поверхность печени. Используйте небольшие ножницы, чтобы тщательно прорезать связки подключения печени к другим органам в животе.
Затем прорезать общий желчный проток, чтобы отделить печень от кишечника. Держитесь за желчный пузырь и тщательно удалите печень. Немедленно поместите его в 50 миллилитровую трубку заполнены три четверти с 4%paraformaldehyde.
Чтобы исправить ткани печени, инкубировать его в 4%PFA при четырех градусах по Цельсию в течение 48 часов. После серии этанола моет, мыть печень с очистки агента три раза в течение 30 минут каждый при комнатной температуре. Чтобы начать встраивание, мыть кассету ткани в форме ткани три раза в течение 30 минут в парафиновый воск разогрет до 60 градусов по Цельсию.
Затем заполните ткань плесень с парафиновым воском до трех четвертей высоты и держать его на нагревательный блок при 60 градусов по Цельсию. Поместите печень в форму с брюшной стороны лицом вверх. После тщательного удаления формы из нагревательного блока, поместите верхнюю часть кассеты на форму.
Доверйте с горячим жидким парафином и дайте ему остыть до комнатной температуры на ночь. После удаления блока печени из формы, использовать микротом, чтобы начать секционирование через поверхностную спинную сторону печени, делая пять микрометровых секций. Проверьте поверхностные секции под микроскопом вскрытия, чтобы убедиться, что секции не снотворные или сложенные.
Для обработки слайдов для иммуногистохимии, выберите один слайд на генотип, который будет проанализирован и мыть его в течение 15 минут в ксилена, 100% этанола, 95% этанола и, наконец, 70% этанола. После мытья слайда в ионизированной воде, погрузите его в Tris основе высокого рН антиген поиска раствора. Затем, нагреть его под давлением в скороварке в течение трех минут на 10 фунтов на квадратный дюйм.
После того, как слайд остынет до комнатной температуры, используйте ручку PAP, чтобы наметить разделы на слайде. После мытья с PBS Tween, блокировать секции тканей, добавив 100 микролитров блокирующего раствора на секцию и инкубировать покрыты при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Нанесите 100 микролитров раствора разбавленного антитела, содержащего все три первичных антитела, на каждый раздел и инкубировать их при четырех градусах Цельсия за одну ночь.
После мытья слайдов добавьте 100 микролитров вторичного раствора антител, содержащих как вторичные антитела, так и инкубации в течение одного часа при комнатной температуре. Наконец, нанесите на слайды монтажную среду и крышку. Используйте флуоресцентный микроскоп, чтобы сделать 20-х изображений при 1-м увеличении каждого раздела.
Убедитесь, что каждый портал вены по всей печени изображен. Создайте электронную таблицу со следующими столбцами: номер животного/образца, номер изображения, количество вен портала и количество желчных протоков. Определите и замитмить количество вен портала на изображение для каждого изображения.
Затем определите патентные желчные протоки на каждом изображении, по наличию холангиоцитов, окружающих определяемый люмен. Эти структуры должны быть отделены и отделены мезенхимом от других цитокератин-положительных клеток широкого спектра действия. Одной из основных задач этого метода является выявление патентных желчных протоков.
Определение того, что является патентным каналом, требует анализа формы протока и клеток, окружающих люмен. Подсчитайте каждый патентный желчный проток и поместите в ту же колонку, что и число изображений, и повторите для каждого изображения вены портала. Наконец, рассчитать сумму всех вен портала и всех желчных протоков в образце печени и рассчитать соотношение желчных протоков к порталу вены для образца печени.
P30 мыши печени были секционированы и совместно окрашенных для CK8 и CK19 вместе с сосудистым маркером, альфа-SMA, чтобы определить соотношение BD к PV. Когда все вены портала в каждой доле печени изображены, портал вены были определены как альфа-SMA окрашенных сосудов, которые имеют смежные широкого спектра спектра цитокератина окрашивания. Альфа-SMA пятна структур без широкого спектра цитокератина были центральные вены, которые были исключены из анализа.
Патентные протоки имеют четко определяемый люмен, который окружен цитокератин-положительными холангиоктами широкого спектра и обычно отделен от близлежащих протоков или холангиоцитов мезенхимом. Широкочастотные цитокератин-положительные клетки, не имеют определяемого люмена, не учитываются в общем количестве желчных протоков. Раздел печени от животного дикого типа показывает портвейн вены, связанные с полностью патентным каналом вместе с несколькими неинкорпорированными клетками.
Представитель печени разделе от JAG1 гетерозиготных животных показывает, никаких патентных желчных протоков присутствуют вокруг трех вен портала. Все цитокератин-положительные клетки широкого спектра действия здесь неинкорпорированы и поэтому не должны считаться. Анализ соотношения BD к PV для трех диких и трех гетерозиготных животных JAG1 показывает, как можно легко отличить два генотипа на основе количество желчных протоков.
Важно оценить все портвейные сосуды для желчных протоков. Это особенно важно для определения плотности желчных протоков, если есть фенотипическая изменчивость по всей печени. Этот метод был использован для выявления генетического супрессора фенотипа желчных в мышиной модели Хельгасона.
Поэтому он может быть полезен при оценке методов лечения животных моделей желчных заболеваний.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.