Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Flödescytometrisk analys av mitokondriella reaktiva syreradikaler i murina hematopoietiska Stem och progenitorceller och MLL-AF9 driven leukemi
Chapters
Summary September 5th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en metod för att använda multiparametrar flödescytometri för att detektera mitokondriella reaktiva syreradikaler (ros) i murina friska hematopoietiska stamceller och stamceller (hspcs) och leukemiceller från en musmodell av akut myeloisk leukemi (AML) driven av MLL-AF9.
Transcript
Reaktiva syrearter eller ROS, är mycket reaktiva syrearter som produceras av celler, och påverkar deras beteende. Även överskott ROS kan också orsaka utbredd cellulär förödelse, och i svåra fall, celldöd. Således är upprätthållandet av ROS homeostas av grundläggande betydelse för cellulär funktion och överlevnad.
Protokollet presenteras här, fokuserar på att mäta en specifik typ av ROS, som genereras av mitokondrier, främst som en metabolisk av produkten i levande, normal, eller friska hematopoietic stam och stamceller populationer, samt i leukemi celler från musmodell av blodcancer, Akut Myeloisk leukemi eller AML. Detta protokoll kan också användas för att utvärdera hur genetisk manipulation, såsom genrade deletion eller överuttryck, påverkar mitokondriellt ROS i flera friska och maligna hematopoetiska populationer. Och som ett resultat, potentiellt ge insiktsfull information om redux tillstånd och eventuellt metabolismen av cellerna.
Denna teknik auktoriserar flöde settle metrisk analys av en protogenic sond för att övervaka mitokondriell ROS produktion i levande friska och maligna hematopoietic stam och progenitor sub-populationer. Detta protokoll är okomplicerat och kan slutföras på några timmar. Dessutom är det lämpligt för levande cellanalys och möjliggör för att skilja och analysera mitokondriellt ROS i stamceller befolkningen i benmärgen, med hjälp av ytmärke av färgning.
Efter att ha samlat mononukleära benmärgsceller från vilda trånga möss och leukemic MLL-AF9 möss, enligt manuskriptet, aliquot 200 mikroliter av cellen suspension i var och en av nio enda färg kontrollrör. Aliquot de återstående cellerna i andra experimentella rör, 200 mikroliter vardera. Placera sedan i en centrifug två experimentella rör som innehåller benmärgsceller och leukemiceller respektive, och ett kontrollrör.
Centrifugera vid 300 gånger G i fem minuter. Därefter dekantera supernatanten, och åter upphäva cellerna i rumstemperatur F-PBS med en levande / död cell fläck, enligt tillverkarens instruktioner. Inkubera på is i 30 minuter.
Efteråt, tillsätt 1 milliliter av rumstemperatur F-PBS till de tre levande / döda färgade rör, och en enda färg kontrollrör för mitokondriellt ROS färgning färgning. Placera rören i centrifugen vid 300 gånger G i fem minuter i rumstemperatur. Därefter, få en 5 millimolar mitokondriellt ROS färgämne stamlösning genom att åter upphäva 50 mikrogram mitokondriellt ROS färgämne i 13 mikroliter av DMSO.
Tillsätt sedan 13 milliliter rumstemperatur F-PBS till 13 mikroliter mitokondriellt ROS färgämne att späda ut till en slutlig koncentration av fem mikromolar. Tillsätt vid behov 13 mikroliter på 50 millimolar Verapamil till lösningen för att hämma mitokondriella effluxpumpar. Erhåll rören från centrifug och aspirera bort tvätten av den levande/ döda cellfläcken.
Lägg till 200 mikroliter av F-PBS i live / dead färgning kontroll och hålla den i is tills redo att starta analysen. Tillsätt 200 mikroliter av mitokondriellt ROS färgämne fläcken som innehåller Verapamil, till varje experimentellt rör, liksom mitokondriellt ROS färgning kontrollröret. Vortex att blanda och inkubera i 10 minuter vid 37 grader Celsius i mörkret.
Tillsätt sedan 1 milliliter rumstemperatur F-PBS till kontroll- och experimentrören. Centrifug fem minuter vid 300 gånger G vid rumstemperatur. Aspirera av supernatent och tvätta cellerna med ytterligare en milliliter rumstemperatur F-PBS.
Centrifugera igen i fem minuter vid 300 gånger G, vid rumstemperatur. Först förbereda två antikropp cocktails för friska och leukemi benmärgsceller. Aspirera supernatanten från det experimentella röret som innehåller friska benmärgsceller, och tillsätt 200 mikroliter av antikroppscocktailen nummer ett till röret.
Vortex att blanda. Förbered även de enda färgkontrollrören genom att tillsätta 200 mikroliter av F-PBS och en mikroliter av motsvarande antikropp. Inkubera i 60 minuter på is i mörkret.
Aspirera supernatanten från det experimentella röret som innehåller leukemibenmärg, och tillsätt 200 mikroliter av antikroppscocktailen nummer två, till röret. Vortex att blanda. Inkubera i 60 minuter på is i mörkret.
Därefter tvättar du alla rören med 1 milliliter kall F-PBS och centrifug i fem minuter vid 300 gånger G vid rumstemperatur. Åter avbryta cellerna i 500 mikroliter av kalla F-PBS. Överför cellupphängningen till varje flödescytmeterrör med ett 40-mikrometerfilter för exkluderande aggregat.
Först, sätt in en ingen fläck kontrollröret i flödet cytometry maskinen och starta förvärvet för att kompensera flödet cytometri maskin. Upprepa för andra manöverrör. Efteråt, läs de experimentella rören för att ställa in grindarna.
För att analysera storlek och komplexitet av cellpopulationen, först för friska HSPC, ställa in den framåt scatter område och sidan scatter område tomter populationer. Tryck på Square Gate-knappen, för att grind ut främmande skräp från framåt och sida scatter tomt. Sedan, på en framåt scatter område och höjd tomt, använd en dubbel discriminator att gate ut dubbletar.
Markera levande celler, härstamning låga celler och de olika friska HSPC. För varje population av intresse, analysera medianen fluorescens intensiteten av TRPE-kanalen i en histagram plot, att utvärdera skillnader i mitokondriellt ROS signal. Upprepa samma förfarande av storleksanalys, gating och histogram plottning för leukemi populationer.
Benmärgsceller isolerade från friska möss var färgas med en levande / döda färgämne och en mitokondriell ROS färgämne, och därefter färgas med antikroppar erkänner härstamning markörer:plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 och CD150. Dessutom var benmärgsceller från leukemi möss också färgas med CD45.2 att diskriminera mellan MLL-AF9 leukemi celler från friska mottagare benmärg celler färgas med CD45.1. En jämförelse av mitokondriellt ROS färgning, mellan friska CD48 negativa LSK, och myeloida progenitors, visar att myeloida progenitorer visa betydligt högre nivåer av mitokondriellt ROS färgning.
Dessutom, c-Kit hög leukemi föregångare visa betydligt högre nivåer av mitokondriell ROS färgning, jämfört med c-Kit mellanliggande låg leukemi celler, friska CD48 negativa LSK och myeloida progenitors. C-Kit mellanliggande låg leukemiceller, visas också ett betydligt högre värde jämfört med CD48 negativa LSK celler, men inte till myeloida stamceller. Mitokondriella ROS-färgämnen är mycket reaktiva och lämpliga tvättsteg behövs för att säkerställa att eventuellt överskott av färgämnet har tagits bort innan följande steg påbörjas.
Det finns flera kemiskt distinkta ROS fluorogena färgämnen som kan användas i detta protokoll, för att uppnå lite kunskap om redux status i levande hematopoetiska celler. Denna teknik har använts i stor utsträckning i litteraturen, och kan ge användbara insikter om metaboliska och signalering vägar som är differentiellt regleras i leukemiceller, om jämfört med deras normala motsvarigheter.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
