Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En semi-kvantitativ narkotika affinitet responsiv Target stabilitet (dart)-analysen for å studere Rapamycin/mTOR interaksjon
Chapters
Summary August 27th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
I denne studien har vi forbedret Dataanalysefunksjonene i dart-eksperimentet ved å overvåke endringene i protein stabiliteten og estimere affinitet til protein ligand interaksjoner. Samspillet kan tegnes inn i to kurver: en proteolytiske kurve og en dose-avhengighet kurve. Vi har brukt mTOR-Rapamycin interaksjon som en eksemplarisk sak.
Transcript
Legemiddelaffinitet responsiv målstabilitet, DARTS, er en robust metode for påvisning av nye småmolekylproteinmål. Den kan brukes til å verifisere kjente småmolekylproteininteraksjoner og for å finne potensielle proteinmål for naturlige produkter. I denne studien forbedrer vi ytterligere dataanalysefunksjonene til DARTS-eksperimentet ved å overvåke endringene i proteinstabilitet og estimere affiniteten til protein-ligand interaksjoner.
Protein-ligand interaksjoner kan plottes mot to kurver, en proteolytisk kurve og en dose-avhengighet kurve. Vi har brukt mTOR-rapamycin interaksjon som en eksemplarisk sak for etableringen av vår protokoll. Vokse 293T celler ved hjelp av DMEM med 10% fosterbovin serum, to-millimolar glutamin, og 1% antibiotika.
Inkuber kulturene ved 37 grader Celsius under 5%karbondioksid. Når kulturen når 80 til 90% samløpet, vask cellene to ganger med kald PBS. Bruk en celleskraper til å samle cellene til en passende mengde kaldcellelysbuffer og overføre lysingcellene til et 1,5-millimeter rør.
Inverter for å blande lysisbufferen og lysingcellene godt og inkubere røret på is i 10 minutter. Sentrifuger røret ved 18.000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatanten til et nytt 1,5-milliliter rør og hold deg avkjølt på is.
Utfør BCA-analysen for å tilnærme proteinkonsentrasjonen av lysater og beregne fortynningen av pronase basert på proteinkonsentrasjonen. Først overfører du lysatet til to 1,5-milliliter rør, 99 mikroliter hver. Tilsett en mikroliter av småmolekyllagerløsning til hver aliquot av lysate og inkuber de to rørene i 30 til 60 minutter ved romtemperatur med risting.
På is, etablere seriell fortynning av nyopptinet pronase løsning i 1x TNC. Etter inkubasjonen med det lille molekylet, del hver aliquot i 20 mikroliter av prøver i fem rør. For å sikre samme fordøyelsestid, med spesifikke intervaller på hvert 30.
For én kontrollgruppe legger du til to mikroliter med TNC-buffer. Etter fem til 20 minutter, stopp fordøyelsen av de seks rørene via tillegg av to mikroliter med kald 20x proteasehemmercocktail med 30-sekunders intervaller. Bland godt og inkuber på is i 10 minutter.
Fortynn hver prøve med seks mikroliter på 5x SDS-PAGE lasting buffer og koke prøvene i et vannbad på 70 grader Celsius i 10 minutter. Nå, for å utføre vestlig flekk, laster du like mengder protein inn i brønnene til en 8% SDS-PAGE gel, sammen med en passende molekylær vektmarkør. Kjør gelen i 30 minutter ved 80 volt, juster deretter spenningen til 120 volt og fortsett å kjøre i en til to timer.
Kontroller at det lille molekylet kan binde seg direkte til de potensielle målproteinene. I denne protokollen bekreftet inkubasjon med det lille molekylet beskyttelsen mot proteolyse. Tre band ble funnet å være beskyttet av inkubasjon med rapamycin over kjøretøykontroll.
Vestlig blotting illustrerte tilstedeværelsen av mTOR-protein ved lave pronase-til-proteinforhold og reduksjon og tap med økende forholdstall. Proteolyse av mTOR av pronase ble tydelig hemmet av tilstedeværelsen av rapamycin og tilsetning av rapamycin genererte et åpenbart skifte i proteolytisk kurve. Rapamycin doseavhengig forbedret nivået av mTOR, noe som tyder på den økende stabiliteten til mTOR med rapamycinbehandling.
Kvantifisering av målproteinbåndintensitetene antydet at mTOR er målproteinet for rapamycin. For å få den beste trinnvise effekten, kan dette eksperimentet måtte gjentas flere ganger for å oppnå et passende utvalg av pronase over proteinforhold.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
