Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Полуколичественный препарат affinity Ответственный Целевой стабильности (DARTS) спросить для изучения Rapamycin / mTOR взаимодействия
Chapters
Summary August 27th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
В этом исследовании мы расширили возможности анализа данных эксперимента DARTS, отслеживая изменения в стабильности белка и оценивая сродство белково-лигандовых взаимодействий. Взаимодействия могут быть построены на две кривые: протеолитическая кривая и кривая доза-зависимости. Мы использовали mTOR-rapamycin взаимодействия в качестве образцового случая.
Transcript
Лекарственное сродство реагировать целевой стабильности, DARTS, является надежным методом для обнаружения новых малых молекул белка целей. Он может быть использован для проверки известных взаимодействий мало-молекулы белка и найти потенциальные цели белка для натуральных продуктов. В этом исследовании мы еще больше расширить возможности анализа данных эксперимента DARTS путем мониторинга изменений в стабильности белка и оценки сродства белково-лигандовых взаимодействий.
Белково-лигандовые взаимодействия могут быть построены против двух кривых, протеолитической кривой и кривой зависимости от дозы. Мы использовали взаимодействие mTOR-рапамицин в качестве образцового случая для создания нашего протокола. Выращивайте 293T-клетки с помощью DMEM с 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота, двухмилимолянным глутамином и 1%антибиотиками.
Инкубировать культуры при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислого газа. Когда культура достигает 80 до 90% слияния, мыть клетки дважды с холодной PBS. Используйте сотовый скребок, чтобы собрать клетки в соответствующее количество холодного буфера лиза клетки и передать лизирование клеток в 1,5-миллиметровую трубку.
Инвертировать, чтобы смешать буфер лиза и лизирование клеток хорошо и инкубировать трубку на льду в течение 10 минут. Центрифуга трубки при 18 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую трубку и держите охлажденным на льду.
Выполните анализ BCA, чтобы приблизить концентрацию белка лисатов и рассчитать разбавление проназ на основе концентрации белка. Во-первых, перенесите лизат в две 1,5-миллилитровые трубки по 99 микролитров каждая. Добавьте один микролитер раствора мелкокаликулярного бульона к каждой алициту лизата и инкубировать две трубки в течение 30-60 минут при комнатной температуре при встряхивании.
На льду устанавливают серийные разбавления свежеоттая проназного раствора в 1x ТНК. После инкубации с небольшой молекулой, разделить каждый aliquot на 20 микролитров образцов в пяти трубках. Чтобы обеспечить одинаковое время пищеварения, через определенные промежутки времени каждые 30 секунд, добавьте два микролитера подготовленных проназных растворов в образцы соответственно.
Для одной контрольной группы добавьте два микролитера буфера ТНК. Через 5-20 минут, остановить переваривание шести труб через добавление двух микролитров холодного 20x ингибитора протеазы коктейль с 30-секундными интервалами. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 10 минут.
Разбавить каждый образец шестью микролитров 5x SDS-PAGE загрузки буфера и варить образцы в водяной бане при 70 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Теперь, для выполнения западной помарки, загрузите равное количество белка в скважины геля 8%SDS-PAGE, а также соответствующий молекулярный маркер веса. Запустите гель в течение 30 минут на 80 вольт, затем отрегулируйте напряжение до 120 вольт и продолжайте работать в течение одного-двух часов.
Убедитесь, что небольшая молекула может связываться непосредственно с потенциальными белками-мишенями. В этом протоколе инкубация с небольшой молекулой подтвердила защиту от протеолиза. Было установлено, что три группы защищены инкубацией рапамицином для управления транспортным средством.
Западные blotting проиллюстрировали при наличии белка mTOR при низких соотношениях проназ к белку и его уменьшение и потерю с увеличением соотношения. Протеолиз mTOR проназой был явно ингибируется наличием рапамицина и добавление рапамицина вызвало очевидный сдвиг в протеолитической кривой. Доза рапамицина зависит от повышения уровня mTOR, что свидетельствует о повышении устойчивости mTOR с лечением рапамицином.
Количественная оценка интенсивности целевой белковой полосы свидетельствует о том, что mTOR является целевым белком рапамицина. Для того, чтобы получить лучший эффект шаг за шагом, этот эксперимент, возможно, придется повторить несколько раз, чтобы получить подходящий диапазон проназа над соотношением белка.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
