Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Использование ближнего инфракрасного флуоресценции и высокого разрешения сканирования для измерения экспрессии белка в мозге грызунов
Chapters
Summary May 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь мы представляем протокол, который использует инфракрасные красители в сочетании с иммуногистохимии и сканирование с высоким разрешением на белки анализа в областях мозга.
Transcript
Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет количественно определить два белка в той же области мозга. Это позволяет экспериментатору смотреть на активность в молекулярных сигнальных путей в регионах мозга путем анализа кастрюли и фосфопротеинов. Он также может быть использован для анализа белков, которые являются маркерами различных когнитивных явлений.
Мы используем относительно простой метод, такой как иммуногистохимия, чтобы ответить на вопросы, которые обычно требуют более активного участия методов. В том числе изучение активности молекулярных сигнальных путей, изучение соотношения АМРА/НМДА. Используя криостат поддерживается между минус 9 градусов по Цельсию и минус 12 градусов по Цельсию, ломтик ранее изолированных и замороженных крыс мозга в областях, представляющих интерес на 30-50 микрометров.
Непосредственно монтировать ломтики на стеклянные горки и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию до иммуноцитохимии. Удалите стеклянные горки из морозильной камеры и дайте им равноденствия до комнатной температуры в течение 30 минут. Работая под капотом дыма, поместите слайды в 4%paraformaldehyde в 0,1 моляра PBS в течение одного-двух часов при комнатной температуре для фиксации тканей.
Затем промыть слайды в 0,1 молар TBS три раза в течение 10 минут каждый. Чтобы пронизать клеточные мембраны, инкубировать слайды в мягком моющее средство в течение 30-60 минут. И промыть снова в TBS три раза в течение 15 минут каждый.
Разбавить первичное антитело для белка, представляющих интерес в PBS в правильной концентрации, как описано в рукописи. Пипетт первичного раствора антител непосредственно на ткани мозга. Поместите крышку скользит на слайдах и инкубировать ткани мозга в первичном разбавлении антител в течение 1-2 часов при комнатной температуре.
После инкубации, удалить крышку скользит и мыть слайды в TBS, который имеет небольшое количество моющего средства добавил к нему, четыре раза в течение 15 минут каждый. Разбавить вторичные антитела в разбавлении, содержащем TBS, моющее средство, и 1,5% принимающей сыворотки. Добавить вторичное антитело к слайдам, накрыть крышкой скользит и инкубировать при комнатной температуре в течение двух часов.
После инкубации, промыть слайды в TBS-T четыре раза в течение 20 минут каждый, а затем в TBS четыре раза в течение 20 минут каждый. Высушите горки при комнатной температуре в темноте, на ночь. Поместите слайды на интерфейс ближнего инфракрасного сканирования с тканью лицом вниз.
Изображение несколько слайдов одновременно с помощью инструмента выбора. Изображение слайдов с использованием параметра высочайшего качества с разрешением 21 микрометр. В смещении нулевых нанометров, импорт изображения в программное обеспечение анализа изображений для просмотра и отметки для полуколичного анализа белка.
Открыв программное обеспечение для анализа изображений, выберите рабочую область, в которую было отсканировано изображение. Затем откройте отсканированное изображение в программном обеспечении для анализа изображений для просмотра сканирования и регулировки длин волн, контрастности, яркости и увеличения, показанных без изменения необработаного изображения или общего количественного излучения. После определения ключевых областей для количественной оценки выберите вкладку анализа в верхней части страницы, а затем выберите прямоугольник рисовать, чтобы нарисовать прямоугольник над областью, которая будет количественно.
Чтобы просмотреть размер прямоугольника, выберите фигуры в левом нижнем углу экрана. Затем выберите столбцы в правом нижнем углу. Затем добавьте столбцы высоты и ширины, чтобы определить размер формы.
Наконец, назовите форму и повторите. После того, как все регионы будут отобраны, приступить к объединению и анализу данных, доступных из вкладки столбцов. Чтобы убедиться, что этот протокол работает, секции мозга были инкубированы с первичными и вторичными антителами, вторичными антителами в одиночку, или ни первичными, ни вторичными антителами.
Непосредственное раннее экспрессия гена c-jun было обнаружено в спинном гиппокампе и миндалинах только тогда, когда к тканям мозга применялись как первичные, так и вторичные антитела. Подугнуля GluR1 рецептора АМРА и подугнуля рецептора NMDA NR2A были анализированы при обнаружении белка стула в ядрах миндалины. Это позволило изучить соотношение рецепторов AMPA NMDA в подядерах миндалины, которая является нейробиологической подписью обучения и памяти.
Средние и нормализованные показатели экспрессии белка были получены в результате сканирования высокого разрешения в брюшном гиппокампе. Используя программное обеспечение анализа изображений, прямоугольник помещается в области интереса и средняя интенсивность света от формы был использован в качестве меры экспрессии флюорофора, который является мерой экспрессии белка. Для получения нормализованной кривой, форма была помещена через область, которая выражает высокий сигнал и низкий сигнал в области под кривой был использован в качестве меры экспрессии белка.
Самая большая борьба с этой процедурой находит антитела и убедившись, что она работает. Приложение простое. Мой совет был бы сначала попытка регулярной иммуногистохимической процедуры, а затем попробовать эту технику.
Всегда выполняя анализ проверки в первую очередь. Самое главное помнить, чтобы проверить ваши антитела разбавления и убедитесь, что он применяется правильно. Без этих шагов процедура провалится.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
