Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten
Chapters
Summary May 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een protocol dat near-infrarood kleurstoffen gebruikt in combinatie met Immunohistochemistry en hoge-resolutie scannen naar eiwitten in hersengebieden te testen.
Transcript
Dit protocol is belangrijk omdat het het mogelijk maakt voor kwantificering van twee eiwitten in hetzelfde hersengebied. Dit stelt de onderzoeker in staat om te kijken naar de activiteit in moleculaire signalering trajecten in hersengebieden door het testen van pan en fosfoproteïnen. Het kan ook worden gebruikt om eiwitten die markers van verschillende cognitieve verschijnselen te testen.
We gebruiken een relatief eenvoudige techniek, zoals immunohistochemie, om vragen te beantwoorden die doorgaans meer betrokken technieken vereisen. Inclusief het onderzoeken van de activiteit van moleculaire signaleringstrajecten, het onderzoeken van de AMPA/NMDA-verhouding. Met behulp van een cryostat gehandhaafd tussen min 9 graden Celsius en min 12 graden Celsius, slice eerder geïsoleerde en bevroren rat hersenen in regio's van belang op 30-50 micrometer.
Direct plakken op glazen platen en op te slaan bij min 80 graden Celsius tot immunocytochemie. Haal de glazen platen uit de vriezer en laat ze 30 minuten op kamertemperatuur in evenwicht brengen. Onder een rookkap plaatsen de glijbanen in 4%paraformaldehyde gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur voor weefselfixatie.
Spoel vervolgens de dia's in 0,1 molaire TBS drie keer gedurende 10 minuten per stuk. Om celmembranen te doorgronden, incubeer de dia's in een mild wasmiddel gedurende 30-60 minuten. En spoel opnieuw in TBS drie keer gedurende 15 minuten per stuk.
Verdun het primaire antilichaam voor eiwit van belang in PBS in de juiste concentratie zoals beschreven in het manuscript. Pipette primaire antilichaam oplossing direct op het hersenweefsel. Plaats deksel slips op de dia's en incubeer het hersenweefsel in primaire antilichaam verdunning gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur.
Na incubatie, verwijder de deklipjes en was de dia's in TBS die een kleine hoeveelheid wasmiddel toegevoegd aan het, vier keer gedurende 15 minuten elk. Verdun secundair antilichaam in een verdunningsmiddel dat tbs, wasmiddel en 1,5% van het gastheerserum bevat. Voeg secundair antilichaam toe aan de glijbanen, dek af met deklips en broed twee uur lang bij kamertemperatuur in.
Na incubatie, spoel de dia's in TBS-T vier keer gedurende 20 minuten elk en vervolgens in TBS vier keer gedurende 20 minuten elk. Droog de glijbanen op kamertemperatuur in het donker, 's nachts. Plaats dia's op de near-infrared scanning interface met het weefsel naar beneden gericht.
Meerdere dia's tegelijkafbeeldingen met behulp van het selectiegereedschap. Beeld de dia's met de hoogste kwaliteitsinstelling met een resolutie van 21 micrometer. Importeer afbeeldingen in een verschuiving van nul nanometer in beeldanalysesoftware om te bekijken en te markeren voor semikwantificerende eiwitanalyse.
Nadat u de software voor beeldanalyse hebt geopend, selecteert u het werkgebied waarin de afbeelding is gescand. Open vervolgens de gescande afbeelding in de beeldanalysesoftware om de scan te bekijken en golflengten, contrast, helderheid en vergroting aan te passen zonder het ruwe beeld of de totale gekwantificeerde emissie te wijzigen. Nadat u de belangrijkste gebieden voor kwantificering hebt geïdentificeerd, selecteert u het tabblad analyse boven aan de pagina en selecteert u rechthoek tekenen om een rechthoek over het gebied te tekenen dat wordt gekwantificeerd.
Als u de rechthoekgrootte wilt weergeven, selecteert u vormen linksonder in het scherm. Selecteer vervolgens kolommen rechtsonder. Voeg vervolgens hoogte- en breedtekolommen toe om de vormgrootte te identificeren.
Geef ten slotte de vorm een naam en herhaal. Zodra alle regio's zijn bemonsterd, gaat u verder met het combineren en analyseren van de gegevens die beschikbaar zijn op het tabblad Kolommen. Om te controleren of dit protocol werkt, werden hersensecties geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen, secundair antilichaam alleen, noch primair noch secundair antilichaam.
De onmiddellijke vroege gen c-jun expressie werd ontdekt in de dorsale hippocampus en amygdala alleen wanneer zowel primaire als secundaire antilichamen werden toegepast op het hersenweefsel. GluR1 sub-eenheid van AMPA receptor en de NR2A sub-eenheid van NMDA receptor werden onderzocht in de stool eiwit detectie in amygdala kernen. Dit toegestaan het onderzoeken van de verhouding van AMPA NMDA receptoren in sub-kernen van de amygdala dat is een neurobiologische handtekening van leren en geheugen.
Gemiddelde en genormaliseerde metingen van eiwitexpressie werden verkregen uit hoge resolutie scans in de ventrale hippocampus. Met behulp van de beeldanalysesoftware wordt een rechthoek geplaatst in het gebied van belang en werd de gemiddelde intensiteit van het licht van de vorm gebruikt als een maat voor fluorofophore expressie, wat een maat is voor eiwitexpressie. Om de genormaliseerde curve te verkrijgen, werd een vorm geplaatst over een gebied dat een hoog signaal uitdrukt en een laag signaal in het gebied onder de curve werd gebruikt als een maat voor eiwitexpressie.
De grootste strijd met deze procedure is het vinden van een antilichaam en ervoor te zorgen dat het werkt. De toepassing is eenvoudig. Mijn advies zou zijn om eerst een regelmatige immunohistochemische procedure te proberen, probeer dan deze techniek.
Altijd eerst een validatietest uitvoeren. Het belangrijkste om te onthouden is om uw antilichaam verdunning te controleren en zorg ervoor dat het correct wordt toegepast. Zonder deze stappen zal de procedure mislukken.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
