Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En uniform Shear analysen for humant blodplater og Cell Surface reseptorer via Cone-plate Viskosimetri
Chapters
Summary June 5th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en in-løsning metode for å bruke uniform skjær til blodplater overflaten reseptorer ved hjelp av membran-plate viskosimetri. Denne metoden kan også brukes mer generelt til å bruke skjær til andre celletyper og celle-fragmenter og trenger ikke å målrette et bestemt ligand-reseptor-par.
Transcript
Denne protokollen tillater oss å svare på en rekke spørsmål om hvordan skjær virker på celler i løsningen og gir betydelig kontroll over skjær varighet og størrelse. I motsetning til andre teknikker, som oppdager effekten av skjær på celler som er immobilisert, tillater denne teknikken oss å bruke skjær på celler i løsning og gir seg til et spekter av nedstrøms signaldeteksjonsmetoder. Etter å ha fått perifert blod fra en samtykkende, sunn voksen donor i et 4,5-milliliter rør på 3,8% trisodium citrate, sentrifuge blodet for å oppnå blodplaterikt plasma, og bruk en pipettespiss kuttet i en 45-graders vinkel for å forsiktig fjerne det resulterende topp, overskyet, gult blodplaterikt plasmalag.
Oppnå blodplatetallet via fullstendig blodtelling, og juster blodplatetallet til ca. 2,5 ganger 10 til de femte blodplatene per mikroliter med samlet humant blodplatefattig plasma. Deretter plasserer du suspensjonen ved 22 grader Celsius med mild rotasjon. For ligand behandling, sakte legge antistoffet eller ligand av interesse til blodplater-rik plasma, og bland blodplater forsiktig.
Under inkubasjonen, slå på kjegleplaten viscometer, og sett platetemperaturen til 22 grader Celsius. Etter fem til 10 minutter overfører du det behandlede blodplaterike plasmaet til det temperaturkontrollerte kjegleplateviscometeret direkte i midten av platen, og ta vare på at hele prøven er avsekom mellom kjegle og plate ved kontaktpunktet. For å bruke skjær på prøven, beregn skjær i henhold til viscometerhåndboken, og bruk skjær på prøven med riktig hastighet og varighet.
På slutten av søknaden løfter du kjeglen omtrent to millimeter av platen, slik at prøven forblir i kontakt med både platen og kjeglen, og bruk en gellastende pipettespiss for å samle fem til 10 mikroliter fra midten av prøvevolumet. Inkuber deretter den skjærte prøven med antistoffer mot overflatemarkører av interesse i 20 minutter ved romtemperatur, og fest prøvene i 2% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur. For å analysere prøvene ved strømningscytometri, samle minst 20.000 hendelser for hver tilstand, og kvantifisere signalstyrken til hver fluorescerende markør, ved hjelp av høydeverdien for intensiteten av hver fluorofor.
Bruk deretter en negativ kontroll med storfe serum albumin eller kjøretøy for å tegne en port, unntatt negative bakgrunn fluorescerende hendelser, og kvantifisere prosentandelen av hendelser inne i porten for alle eksperimentelle forhold. Blodplateaktiveringsmarkøruttrykk som svar på skjærkraftapplikasjon er uregulert på en tidsavhengig måte. Her vises representative avlesninger av menneskelig blodplateaktivering i nærvær av to antistoffer rettet mot N-terminaldomenet av glykoprotein 1b-IX og ett kontrollantistoff under skjærede og statiske forhold.
Uttrykket for alle tre aktiveringsmarkører ble betydelig økt i nærvær av skjærkrefter og rettet mot antistoffer, sammenlignet med enten statiske forhold eller i nærvær av kontrollantistoffer. Spesielt utløser behandling med antistoff med en uforpliktende kraft for lav til å utløse glykoprotein 1b-IX-aktivering ikke blodplateaktiveringsmarkør upregulation under statiske eller skjærkraftforhold. Videre, plasma fra immun trombocytopeni pasienter som inneholder antistoffer mot glykoprotein 1b-IX utløse skjær avhengige reaksjoner i motsetning til plasma fra pasienter uten glykoprotein 1b-IX rettet mot antistoffer.
I tillegg til flowcytometriske analyser kan celler som har vært utsatt for skjær også lyses for vestlig flekk, ELISA og massespesifikasjonsanalyse for å bestemme eventuelle endringer i proteinnivået. Som alltid, når du bruker blod eller menneskelige prøver, sørg for å bruke riktig verneutstyr og følg laboratoriet sikkerhet og blod født patogen retningslinjer for institusjonen din.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
