Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Gebruik van Alu Element met minigenen om circulaire RNA's te analyseren
Summary March 10th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We klonen en analyseren reporter genen die circulaire RNA's genereren. Deze reporter genen zijn groter dan constructies om lineaire splicing te analyseren en Alu-elementen bevatten. Om de cirkelvormige RNAs te onderzoeken, worden de constructies omgezet in cellen en wordt resulterend RNA geanalyseerd met behulp van RT-PCR na verwijdering van lineair RNA.
Transcript
Dit protocol is belangrijk omdat het de gebruiker in staat stelt om een genomisch expressiesysteem te genereren dat alternatieve splicing kan ondergaan en in dit geval circulaire RNAs kan vormen die kunnen worden getest op hun functie en ziekteassociatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de weg zal effenen voor anderen om dit protocol te gebruiken in de moleculaire biologie en klonen bij het bestuderen van alternatieve splicing in circulaire RNA formatie en functie. Mijn advies aan iemand proberen deze techniek voor de eerste keer zou zijn om de PCR voorwaarden te optimaliseren.
Voer verlopen uit of voer touchdown PCR uit met verschillende temperaturen en verlengingstijden. Meestal langere fragmenten meer dan zes KB zal een KB per cyclus uit te breiden en verschillende annealing temperaturen zou moeten worden getest op de beste versterking. Demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat het de gebruikers een betere visuele weergave van de moeilijkere aspecten van de procedure met name de generatie van primers zal geven.
Om deze procedure te beginnen, laadt u de UCSC Genome Browser en gebruikt u deze om repetitieve elementen te identificeren die nodig zijn voor de vorming van cirkelrna en deze in de constructies op te nemen. Belangrijk is dat primers voor versterking buiten de repetitieve elementen moeten staan. Plak de cirkelvormige RNA-sequentie in het menselijke BLAT-zoeken en selecteer het juiste organisme.
Verzend de volgorde, ga naar de browserweergave en zoom 1,5 timers of naar gelang van het geval uit. Vervolgens muis over de repetitieve elementen om hun subtype te identificeren in een zwevend venster. Alu elementen zijn in de sinuslijn.
Gebruik de standaardtrackingknop onder het venster om de browser opnieuw in te stellen als er een onjuiste afbeelding wordt verkregen. Ga eerst naar het bekijken, DNA op de bovenste lijn van de USCS Genome Browser om de DNA-sequentie in het venster te downloaden. Selecteer in de optie opmaak voor sequencing de optie Uitgebreide aanvraag-/kleuropties.
Selecteer de standaardcase lager en selecteer de schakelcase voor NCBI RefSeq. Selecteer onderstrepen en vet en cursisch voor RepeatMasker. Klik op verzenden.
Er zullen exons als hoofdletters en intronen als kleine letters. Controleer de exon/intron borders. Als de browser de omgekeerde aanvulling weergeeft, gaat u terug en selecteert u het omgekeerde complementvak totdat de juiste exon/intronranden worden weergegeven.
Kopieer vervolgens het bestand met de juiste afdrukstand naar een tekstverwerkingsdocument en markeer de exonen. Selecteer de te versterken fragmenten, zodat de intron niet begint of eindigt in een repetitief gebied, omdat primers in deze regio's specifieke sequenties niet versterken. Gebruik om te beginnen een webtool om de primers voor klonen te ontwerpen.
Voeg voor de vectorsequentie de invoegplaats toe als laatste nucleotide en voeg vervolgens de fragmenten toe. Aangezien de vectornummering niet begint met een bepaalde invoegplaats, bevindt de plaats van invoegpositie in de vector zich en wordt het downstream-gedeelte voor de upstream-sequentie geplaatst. Pas primers aan als hun smeltpunten meer dan vier graden Celsius uit elkaar liggen en niet werken in versterking.
In deze studie worden reportergenen die circulaire RNAs genereren gekloond en geanalyseerd. Geoptimaliseerde PCR producten worden gescheiden op een 1%agarose gel met 1X gel groen. De afzonderlijke banden vertegenwoordigen de PCR-producten die zullen worden gebruikt in enzymatische DNA-assemblage.
Deze banden worden vervolgens uit de gel gesneden en gezuiverd. Het gezuiverde PCR-product voldoet niet aan de verwachte grootte met gelgroen, zodat de producten ook gescheiden zijn op een 1%agarose gel die vervolgens wordt bevlekt met ethidium bromide om ervoor te zorgen dat de producten de juiste grootte hebben. Om te beginnen, zet een enzymatische DNA assemblage kit.
Combineer de vector en inserts in een kiesverhouding van één tot twee. Voeg vervolgens 10 microliter dna-assemblagemastermix toe. Incubeermonsters gedurende 60 minuten bij 50 graden.
Ontdooi bevoegde cellen op ijs tijdens incubatie. Cellen moeten in een volume van 50 microliter. Transformeer vervolgens competente cellen met de totale montagereactie.
Voeg twee microliter van het gekoelde geassembleerde product toe aan de bevoegde cellen. Meng door zachtjes flicking de buis vier tot vijf keer. Niet vortex.
Zet het mengsel 30 minuten op ijs. Verwarm schok het mengsel op 42 graden Celsius gedurende 30 seconden. Zet het dan twee minuten terug op het ijs.
Voeg hierna 950 microliters van soc-media bij kamertemperatuur toe aan de buis. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende 60 minuten tijdens het schudden op 300 RPM. Tijdens deze incubatie, warme twee selectieplaten die het juiste antibioticum bevatten.
Na de incubatiecentrifugeren de reactiebuis gedurende 30 seconden op 10,000 g om de cellen te pelleteren en 25% van de cellen op de ene selectieplaat en 75% op de andere plaat uit te voeren. Broed deze platen 's nachts bij 37 graden Celsius. Voordat u begint met transfectie, controleer uw DNA door beperking verteren.
Hier wordt een representatieve tau minigene die exons negen tot en met 12 bevat gesneden met beperkingsenzymen die zijn aangegeven om grote recombinaties uit te sluiten. Los voor transfectie eerst lineair polyethyleenhydrchloride op in water bij een concentratie van één milligram per milliliter bij pH twee. Gebruik natriumhydroxide om de pH tot zeven te brengen en steriel filter de oplossing met een filter van 0,22 micrometer.
Bewaar de oplossing op vier graden Celsius tot het gebruiksklaar is. Splits vervolgens de cellen in de putten van een zes-put plaat en laat ze groeien 's nachts op DMEM media met 10%FBS. De volgende dag, aliquot een microgram van het gerapporteerde gen in een steriele buis en voeg 200 microliter van steriele gefilterd 150 millimolar natriumchloride.
Meng door vortexing. Voeg vervolgens de polyethyleenoplossing toe aan dit mengsel met een verhouding van drie microliters polyethyleen voor elk microgram DNA. Centrifuge kort om monsters te verzamelen aan de onderkant van de buis.
Incubeer de monsters op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg het vervolgens direct toe aan HEK293-cellen. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.
De volgende dag gebruikt u een RNA-isolatiekit om het RNA voor RT-PCR te isoleren. cDNA uit twee monsters afkomstig van menselijke hersenweefsels worden versterkt met cirkelvormige RNA primers circ tau exon 1210 reverse en circ tau exon 1211 naar voren. Terwijl de verwachte band die overeenkomt met tau cirkel RNA wordt gezien, de andere sterke banden zijn artefacten die niet overeenkomen met het menselijk genoom.
Dit experiment wordt herhaald met identieke PCR voorwaarden, maar de omgekeerde transcriptie werd alleen uitgevoerd met de circ tau exon 1210 reverse primer. Alleen de verwachte band wordt versterkt en gevalideerd door middel van sequencing. Het RNA wordt vervolgens behandeld met RNase R die lineair RNA verwijdert.
Het cirkelvormige RNA is detecteerbaar na de behandeling, terwijl lineair RNA niet langer een detecteerbaar signaal geeft. RNA is geïsoleerd 24 uur na de transfectie en geanalyseerd door RT-PCR. Versterking van het lineaire tau mRNA toont twee banden als gevolg van alternatieve splicing van exon 10.
Hun verhouding verandert in de over expressie van splicing factoren. Versterking van de circulaire 1210 tau RNA toont de afhankelijkheid van tau circ RNA expressie op de expressie van een aantal splicing factoren met name de Cdc2-achtige kinase CLK2 en het SR-eiwit 9G8. Het belangrijkste om te onthouden bij een poging deze procedure is het ontwerp en de locatie van de primers bij de bouw van een minigene.
De primer mag niet in repetitieve elementen liggen en moet onder verschillende omstandigheden worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het fragment dat wordt versterkt. Na deze procedure zullen andere methoden die kunnen worden uitgevoerd, het testen van de functie van de circulaire RNAs zijn. De gebruikers kunnen vertaling of sekwestratie van eiwitten testen om een functie te identificeren voor het specifieke circulaire RNA waarin de gebruiker geïnteresseerd is.
Deze techniek maakte de weg vrij om genomische fragmenten te gebruiken in een minigeen systeem dat de circulaire RNAs kan uitdrukken, waardoor de gebruiker zijn functie kan testen en identificeren en in sommige aspecten hun associatie met ziekte kan. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot potentiële therapieën en diagnostiek van een bepaalde ziekte, bijvoorbeeld tauopathieën, neurodegeneratieve ziekten geassocieerd met tau pathologie. We hebben ontdekt dat het microtubuli-geassocieerde eiwit tau, bekend als MAPT, circulaire RNAs genereert waarvan wij geloven dat ze bijdragen aan de ziektepathologie en deze methode stelt ons in staat om deze circulaire RNAs volledig te bestuderen en hun functie en relatie met ziekten te identificeren.
Deze methode zou inzicht kunnen geven in een beter begrip van circulaire RNAs, wat hun functies zijn en de rol die zij kunnen spelen bij bepaalde ziekten. Deze methode kan worden toegepast bij het klonen van andere minigenen die circulaire RNAs uitdrukken over soorten waar het inzicht kan geven in hun functie. Versterking van de PCR-producten blijkt het moeilijkst te zijn met lange fragmenten versterkt uit genomisch DNA, samen met het hebben van meerdere repetitieve elementen in het fragment.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
