来自成人大脑的短期自由浮动切片培养

我们提出了一个方案，准备从活的人类捐赠者那里收集的脑组织中自由浮动的切片培养物，用于恢复脑手术。这种培养可进行生化和细胞生物学测定或免疫组织化学。它有望有助于阐明相关脑部疾病中神经退化的机理。

该技术的主要优点是，它是使用膜插入的经典切片培养协议更简单、更具成本效益的替代方案。虽然整体协议并不复杂，但一些步骤，如去除脑膜，将组织粘合到振动组标本盘，以及免疫组织化学的切除，在视觉上演示时，最好了解。帮助演示这个程序的将是尼勒·门德斯和格劳西亚·阿尔梅迪亚是研究生，另一位研究生乔凡娜·诺盖拉。

要开始此过程，请向一桶冰中添加盐。将切片溶液转移到此铲斗中，让它在碳化物混合物下休息至少 20 分钟，然后使用。接下来，准备一块3%的加糖，大约两厘米，两厘米，两厘米。

将阿加罗斯块超级粘附到振动组试样盘上，以便在切片过程中为组织样品创建额外的机械支撑。在振动器上，将截面厚度设置为 200 微米，将振动频率设置为 100 赫兹，并选择 0.5 至 1.0 毫米/秒的切片速度。然后将振动器缓冲盘锁定到振动组底部，并添加冰，在接收切片溶液和样品之前以及在整个切片过程中将其冷藏。

首先，设置一个运输装置，由一个便携式气瓶组成，其中包含一个碳化物混合物，该气瓶与压力通量阀相连，控制连接到硅胶管的气体输出，该油管将气体输出连接到运输容器和运输容器，该容器包含运输溶液和运输过程中用于样品冷却的冰。收集和运输标本和运输，如文本协议中所述。将试样转移到含有切片溶液的培养皿中。

使用精细的手术工具，小心地去除尽可能多的剩余毛细。选择具有实验设计特殊特性的切片的最佳试样方向，并使用编号 24 手术刀刀片修剪平坦表面，作为将粘附在试样盘上的底座。使用处置塑料勺子和精致的画笔，从培养皿中收集碎片，然后用滤纸擦干多余的溶液。

接下来，使用超级胶水将组织附着在振动器试盘上，直到它牢牢地粘在培养皿上，并接触阿加罗斯块。将振动器试样盘放入振动器缓冲盘中。用剃刀刀片牢固地固定，将刀架锁定到位。

添加切片溶液，并确保它覆盖试样和刀片。然后开始将试样切成200微米切片。将切片从缓冲盘转移到含有切片溶液的培养皿中，并修剪任何松散的边缘和多余的白物质，以大约 70%皮层和 30% 白物质的比例。

在层流柜中，在24井板的每个井中加入600微升培养基，并在36摄氏度下孵育，在电镀切片前至少20分钟用5%的二氧化碳孵育。在此之后，使用画笔在每个井中镀一片。如果盘子里有任何未使用的水井，请用400微升无菌水填充。

在36摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。补充10毫升先前准备的培养基与大脑衍生的神经营养因子，浓度为每毫升50毫微克。8 至 16 小时后，从每井中去除 333 微升的调节介质，并添加 133 微升新鲜 BDNF 补充介质。

每24小时用新鲜的BDNF补充介质更换三分之一的调节介质。首先，将切片从含有培养介质的井转移到新的含有PBS的24孔板。从每一个井中去除PBS，代之以1毫升4%的甲醛。

在摄氏四度下孵育过夜。第二天，小心地从井中去除甲状甲醛，代之以一毫升30%蔗糖溶液。在4摄氏度下孵育48小时。

48小时后，将冷冻微原子设置为负40摄氏度。在应放置切片的微原子阶段准备蔗糖基座。完全冷冻后，切开一些冷冻蔗糖，以产生一个平面，将切片放置在该表面。

接下来，将每片片放在拉伸的塑料薄膜上，用画笔将组织压平。在一次移动中，将拉伸切片转移到冷冻蔗糖基座。切片休息5至10分钟后，正确冷冻，将切片切成30微米部分。

将 30 微米部分转移到含有 PBS 的培养皿中，然后执行足以进行实验设计的组织学方案。在确定培养切片的质量和运行状况时，要评估的一个关键方面是预期神经细胞类型、神经元和胶质细胞的存在和典型形态。人体皮质层压的典型结构在体外四天通过神经元免疫标记揭示的切片中观察到。

此外，还观察到微胶质和天文胶质的预期存在。这些结果表明，组织结构不受外科手术、样品处理或体外短期时间的影响。对氯化钾引起的去极化的神经元反应也通过遵循ERK磷酸化在培养片中量化。

有趣的是，ERK磷酸化明显增加，在体外四天的氯化钾处理切片中。最后，用已知的氧化应激诱导剂过氧化氢评估了天体外四片对毒性挑战的反应。将切片暴露在 300 毫摩尔过氧化氢 24 小时，导致 MTT 减少的显著减少。

综合起来，在过氧化氢挑战后，在体外五片中观察到的日体中大量细胞死亡和氯化钾引起的去极化结果表明，在体外四天的切片保持了总体健康，这些切片对氧化应激等毒性刺激有反应。该协议主要致力于基于持续一周多的测定的研究，如研究候选药物的神经毒性和神经保护的分子机制。虽然该协议致力于使用从患者中收集的皮质组织，用于微抗性叶癫痫的手术治疗，但很可能从其他脑区或条件收集的组织也可以成为产生自由浮动切片培养物的来源。

成人人脑的切片培养可能是促进我们了解人类神经病理学的关键，因为他们独特的细胞电路和分子机械缺乏由啮齿动物大脑产生的切片。