Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein

We presenteren een protocol voor te bereiden vrij zwevende slice culturen uit hersenweefsel verzameld van levende menselijke donoren voorgelegd aan resective hersenchirurgie. Deze cultuur is vatbaar voor het uitvoeren van biochemische en celbiologie testen of immunohistochemie. Het zal naar verwachting bijdragen aan de opheldering van het mechanisme dat ten grondslag ligt aan neurodegeneratie in geassocieerde hersenziekten.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudiger en kosteneffectiever alternatief is voor het klassieke slice cultuur protocol met membraan inserts. Hoewel het algemene protocol niet complex is, zijn sommige stappen zoals het verwijderen van hersenvliezen, het lijmen van het weefsel aan de vibratome specimen schijf, en resectie voor immunohistochemie het best te begrijpen wanneer visueel aangetoond. Helpen om de procedure aan te tonen zullen Niele Mendes en Glaucia Almedia die grad studenten, en Giovanna Nogueira, een andere grad student.

Om deze procedure te beginnen, voeg zout toe aan een emmer ijs. Breng de snijoplossing over op deze emmer en laat deze minstens 20 minuten rusten onder het carbogenmengsel dat voor gebruik borrelt. Bereid vervolgens een blok van 3% agarose dat is ongeveer twee centimeter door twee centimeter door twee centimeter.

Super lijm de agarose blok aan de vibratome monster schijf om extra mechanische ondersteuning van het weefsel monster te creëren tijdens het snijden. Stel op het vibratome de sectiedikte in op 200 micrometer, de trillingsfrequentie op 100 hertz en kies een snijsnelheid tussen 0,5 en 1,0 millimeter per seconde. Vergrendel vervolgens de triombufferlade op de triomebasis en voeg ijs toe om het gekoeld te houden voordat de snijoplossing en het monster en tijdens de snijprocedure worden ontvangen.

In de eerste plaats een transportapparaat opzetten dat bestaat uit een draagbare gasfles die een carbogenmengsel bevat dat is aangesloten op een drukfluxklep die de gasproductie regelt die is aangesloten op siliconenbuizen die die gasproductie verbinden met het transportschip en het transportschip dat de transportoplossing en ijs voor monsterkoeling tijdens het transport bevat. Verzamel en transport het monster en transport zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng het monster over op een petrischaaltje met snijoplossing.

Verwijder met behulp van fijne chirurgische hulpmiddelen voorzichtig zoveel mogelijk van de resterende hersenvliezen. Kies de beste monster oriëntatie voor het produceren van plakjes met de bijzondere kenmerken van het experimentele ontwerp en gebruik een nummer 24 scalpel blad om een plat oppervlak trim om de basis die zal worden gelijmd aan het monster schijf. Met behulp van een verwijdering plastic lepel en delicate kwasten, het verzamelen van het fragment uit de petrischaal en afdrogen overtollige oplossing met filterpapier.

Gebruik vervolgens superlijm om het weefsel aan de vibratome specimen schotel te bevestigen totdat het stevig aan de schotel wordt bevestigd en in contact komt met het agaroseblok. Plaats de vibratome specimen disc in de vibratome buffer tray. Sluit de messenhouder op zijn plaats met het scheermesje stevig vast.

Voeg de snijoplossing toe en zorg ervoor dat het zowel het monster als het mes bedekt. Dan beginnen snijden het monster in 200 micrometer plakjes. Breng de plakjes van de bufferlade naar een petrischaaltje met snijoplossing en snijd losse randen en overtollige witte stof bij tot een percentage van ongeveer 70% cortex en 30% witte stof.

In een laminaire stroomkast, voeg 600 microliters van cultuur medium om elke put van een 24-put plaat en incubbate op 36 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende ten minste 20 minuten voorafgaand aan het plating van de plakjes. Gebruik hierna een kwast om in elke put een plakje te maken. Als er ongebruikte putten in de plaat zitten, vul ze dan met 400 microliter steriel water.

Incubeer bij 36 graden Celsius met 5%kooldioxide. Supplement 10 milliliter van de eerder voorbereide cultuur medium met de hersenen afgeleide neurotrofe factor bij een concentratie van 50 nanogram per milliliter. Na acht tot 16 uur, verwijder 333 microliter van het geconditioneerde medium uit elke put en voeg 133 microliter vers BDNF aangevuld medium.

Vervang een derde van het geconditioneerde medium elke 24 uur door vers BDNF-medium. Breng eerst de plakjes van de putten met kweekmedium over naar een nieuwe 24-putplaat met PBS. Verwijder de PBS uit elke put en vervang deze door een milliliter van 4%paraformaldehyde.

Incubeer ‘s nachts bij vier graden Celsius. De volgende dag, voorzichtig verwijderen van de paraformaldehyde uit de putten en vervang het door een milliliter van 30% sacharose oplossing. Incubeer op vier graden Celsius gedurende 48 uur.

Na 48 uur, zet het invriezen microtome op negatieve 40 graden Celsius. Bereid een sacharose basis op de microtome stadium waar de plakjes moeten worden geplaatst. Nadat het volledig is bevroren, snijd een deel van de bevroren sacharose om een vlakke ondergrond waarop de plak zal worden geplaatst te produceren.

Plaats vervolgens elk plakje over een uitgerekte plastic folie en gebruik een penseel om het weefsel plat te maken. Breng in één beweging het uitgerekte segment over naar de bevroren sacharosebasis. Nadat het segment vijf tot tien minuten heeft rusten om goed te bevriezen, snijd u het plakje in secties van 30 micrometer.

Breng de 30 micrometer secties over op een petrischaaltje met PBS en ga naar een histologieprotocol dat geschikt is voor het experimentele ontwerp. Bij het bepalen van de kwaliteit en gezondheid van gekweekte segmenten, een cruciaal aspect te evalueren is de aanwezigheid en typische morfologie van de verwachte neurale cel types, neuronen en gliacellen. De typische architectuur van de menselijke corticale laminatie wordt waargenomen in een segment op dag in vitro vier onthuld door neuronale immunolabeling.

Daarnaast wordt ook de verwachte aanwezigheid van microglia en astroglia waargenomen. Deze resultaten tonen aan dat weefselarchitectuur niet significant wordt beïnvloed, noch door de chirurgische ingreep, de monsterverwerking of door de korte termijn periode in vitro. De neuronale respons op kaliumchloride-geïnduceerde depolarisatie zijn ook gekwantificeerd in gekweekte plakjes door het volgen van ERK fosforylatie.

Interessant is dat een duidelijke toename van ERK-fosforylatie wordt gezien in met kaliumchloride behandelde plakjes op dag in vitro four. Ten slotte wordt de reactie van plakjes op dag in vitro vier op een toxische uitdaging geëvalueerd met een bekende oxidatieve stress inducer waterstofperoxide. Het blootstellen van de plakjes aan 300 millimolar waterstofperoxide gedurende 24 uur leidde tot een robuuste daling van de MTT-reductie.

Samen, de massale celdood waargenomen in dag in vitro vijf plakjes na de waterstofperoxide uitdaging en de kaliumchloride-geïnduceerde depolarisatie resultaten geven de behouden algemene gezondheid van plakjes op dag in vitro vier die reageren op een toxische stimulus zoals oxidatieve stress. Dit protocol is voornamelijk gewijd aan studies op basis van tests van meer dan een week, zoals het onderzoek van moleculaire mechanismen van neurotoxiciteit en neuroprotectie door kandidaat-geneesmiddelen. Hoewel dit protocol is gewijd aan het gebruik van corticale weefsel verzameld van patiënten voorgelegd aan chirurgische behandeling voor micro-resistente temporale kwab epilepsie, is het waarschijnlijk dat weefsel verzameld uit andere hersengebieden of aandoeningen kunnen ook bronnen om vrij zwevende slice culturen te produceren.

Slice culturen uit volwassen menselijke hersenen kan de sleutel zijn in het bevorderen van ons begrip van de menselijke neuropathologieën als gevolg van hun unieke cellulaire circuits en moleculaire machines ontbreekt in plakjes geproduceerd uit knaagdier hersenen.